响应面法优化产丙酸杆菌素菌株的培养条件

王海晶，王玉华，齐斌

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，长春130118；2.常熟理工学院发酵工程技术研究中心，江苏常熟215500；3.苏州市食品生物技术重点实验室，江苏常熟215500）

响应面法优化产丙酸杆菌素菌株的培养条件

王海晶1，王玉华1，齐斌2，3

（1.吉林农业大学食品科学与工程学院，长春130118；2.常熟理工学院发酵工程技术研究中心，江苏常熟215500；3.苏州市食品生物技术重点实验室，江苏常熟215500）

响应面法已成功运用于发酵过程的优化，可以对发酵培养基及培养条件等诸多因素进行考察和评价，从而有效地确定重要因子的最优水平，取得更好的发酵效果，因此本文主要采用响应面法对丙酸杆菌素产生菌株的发酵培养基进行优化，以提高丙酸杆菌素抑菌能力。首先采用Plackett-Burman(PB)试验设计法筛选出3个主要因素为葡萄糖、Tween80和pH值，然后通过最陡爬坡法和响应面分析方法确定主要因素的最佳质量浓度分别为：葡萄糖2.32 g/L，Tween80 0.1 g/L，pH值为7.0。在优化条件下丙酸杆菌素抑菌能力增强，形成的抑菌圈直径是24.76 mm，是优化前的1.25倍。

丙酸杆菌素；Plackett-Burman试验；最陡爬坡法；响应面分析方法

0 引言

乳品丙酸杆菌是一种存在于发酵乳制品中的革兰氏阳性益生细菌，被认为是安全的菌种[1]，它能够利用乳酸合成丙酸、乙酸、VB12、叶酸[2]、生物素和细菌素。丙酸杆菌细菌素是乳品丙酸杆菌代谢过程中合成的一种重要的多肽或蛋白质，它能抑制乳品中革兰氏阳性细菌的生长并杀死乳品中的霉菌和酵母，从而抑制乳制品变质[3]，目前已经报道的有6种[4-8]。

近年来人们对丙酸杆菌的益生作用进行了大量研究[9-13]。但由于产量低，还未见大规模生产应用的报道，因此提高丙酸杆菌素产量、降低生产成本成为研究的重点。本文在初步优化基础上，采用Plackett-Burman设计法和响应面法相结合的方法对Propionibacterium feudenreichi变异菌株培养条件进行优化，为丙酸杆菌素进一步工业化生产提供理论参考。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 菌种

丙酸杆菌Propionibacterium feudenreichii变异菌株CS01；金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）：ATCC25923。

1.1.2 培养基

种子培养基：乳酸钠20 g/L，酵母膏10 g/L，KH2PO4为1 g/L，MgSO4为0.2 g/L，Tween80为1 g/L，pH值为7.0。

发酵培养基：葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，KH2PO4为1 g/L，MgSO4为0.2 g/L，Tween80为1 g/L，pH值为7.0。

检测培养基：上层为牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂10 g/L，pH值为7.0；下层为琼脂20 g/L。

1.2 方法

1.2.1 丙酸杆菌素溶液的制备

将100 mL丙酸杆菌发酵液4℃，8 000 r/min的条件下离心5 min，在上清液中边搅拌边缓慢加入硫酸铵粉末，硫酸铵终质量分数为70%，继续搅拌均匀，放于4℃冰箱中沉淀过夜，4℃，转速为12 000 r/min的条件下离心15 min，沉淀物加入少量水溶解后，4℃透析48 h，每隔4 h换水1次，再将透析液冷冻干燥，向冻干物中加入100 mL蒸馏水，充分溶解，制成丙酸杆菌素溶液。

1.2.2 抑菌实验

改进的牛津杯-双层平板法[14]。

金黄色葡萄球菌悬液的制备：向37℃培养18 h的金黄色葡萄球菌斜面中加入5 mL无菌生理盐水，将菌落洗下，再用无菌生理盐水稀释成浓度为1.18×107mL-1的指示菌悬液。

检测平皿的制备：在无菌平皿中倒入10 mL已融化的琼脂，凝固后，放入无菌牛津杯（不宜放置太多），将已融化的7.5 mL检测培养基冷却到50℃左右，加入100 μL指示菌悬液，快速充分混匀，倒入平皿，待其凝固。

抑菌活性检测：向牛津杯中加入200 μL丙酸杆菌素溶液，将检测平皿放置在37℃培养箱培养12 h后，测量抑菌圈直径。

1.2.3 培养条件优化

Plackett-Burman（PB）实验：在单因素实验的基础上，本研究选取酵母膏，葡萄糖，KH2PO4，Tween80，发酵时间，pH值，发酵温度，接种量作为PB试验的9个因素，每个因素取两个水平，采用SAS软件进行试验设计、数据回归分析以及建立多项式模型方程，选定出3个主要因素。

最陡爬坡实验[15]：利用最陡爬坡法使PB实验中得到的主要因素逼近最大响应面区域。

响应面法：以Plackett-Burman试验中获得重要因素作为响应面优化的因素，以丙酸杆菌素抑菌圈直径为响应值（Y1），进行中心组合设计并采用SAS软件进行试验设计，数据回归分析以及建立多项式模型方程，确定主要因素的最优浓度水平。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman实验结果

表1为Plackett-Burman实验设计及结果。由表1的结果确定出对产物形成抑菌圈直径影响因素最大的3个主要因素：pH值、葡萄糖、Tween80。

表1 Plackett-Burman实验结果

主要因素的编码多元一次回归方程为

Y=16.34167-1.308333X1+1.475X3+2.291667X7（1）

该方程相关性R2=94.28%，该模型的相关性较好。可以作为以下实验的依据。

2.2 最陡爬坡实验设计和实验结果

表2为最陡爬坡实验设计及结果。由表2可以看出，在0阶段组合实验所测抑菌圈直径最大，达到22.7 mm，所以将该组数据作为响应面实验的中心实验点。

表2 最陡爬坡实验结果

2.3 响应面优化实验

表3为实验因素水平及编码。根据表3水平及编码，设计实验并测量响应值，结果如表4所示。表5为回归系数显著性检验。

表3 实验因素水平及编码

根据实验结果，并利用SAS分析软件进行回归分析，通过t分布和P值来检验各个系数的显著性，考察这3个因素是否有交互作用。P值越小，系数越显著。由表5可以看出，X1和X3对Y1影响显著，X2对Y1影响不显著。二次项对Y1的影响的显著。在交互项上两者的交互作用不显著。即这3个因素之间的交互作用影响较小。表6为回归方程方差分析结果。

表6结果表明：X1，X3，X12，X22，X32项影响是极为显著(P＜0.01)；由此所建立的模型也是极为显著(P＜0.01)；X2，X1X2为显著(P＜0.5)，其中X22的影响较为突出；X2X3影响不显著(P＞0.5)。因此各具体实验因子对响应值的影响不是简单的线性关系，而是呈二次抛物面关系。模型可信度分析如表7所示。

表4 中心组合实验设计及实验结果

表5 显著性检验结果

利用SAS分析软件分析得到真实值的回归方程：

对以上方程进行分析，回归方程R2=95.32%，该方程的拟合效果较好，可信度高。可以将该方程用于模拟实验结果分析。

2.4 响应面三维图和对应等高线图

图1为运用SAS软件分析得到的等高线图和响应面图，从图中可以清晰地看出，各因子对响应值的影响变化趋势和模型存在最大值（即稳点）。

表6 方差分析结果

表7 模型可信度分析

图1 响应面三维图和对应等高线

为了求出稳点对应的编码值，对回归方程取一阶偏导得

解得：X1=0.87，X2=0.17，X3=0.64。即稳定点(X1，X2，X3)的代码值为(0.87，0.17，0.64)。这说明X1（pH值）的最佳范围在6.94左右，X2（Tween80质量浓度）的最佳范围在0.09 g/L左右，X3（葡萄糖浓度）的最佳范围在2.32 g/L左右，此时抑菌圈直径的最大估计值Y=24.83 mm。考虑到实际操作的便利，确定pH值为7.0，Tween80质量浓度为0.1 g/L，葡萄糖质量浓度为2.32 g/L。

为了证实预测的结果，用以上得到的最优配方重复实验5次。抑菌圈直径分别为24.6，24.9，24.7，25.0，24.6 mm。验证实验所得抑菌圈平均值24.76 mm与估计值Y=24.83 mm相差不大，说明回归方程较真实的反映了各因素对代谢物活性的影响，即提供了一个适合的模型。

3 结论

本文通过Plackett-Burman(PB)试验设计法，筛选出了3个主要影响因子为葡萄糖、Tween80和pH值。采用最陡爬坡法和响应面分析方法(RSM)确定其最佳质量浓度分别为：葡萄糖2.32 g/L，Tween80 0.1 g/L，pH值7.0。因此最终确定最佳培养基组分和培养条件：葡萄糖2.32 g/L，酵母膏1.0 g/L，KH2PO40.1 g/L，MgSO40.02 g/L，Tween80 0.1 g/L，pH值为7.0，接种量5%，培养温度30℃，培养时间为9 d。在优化培养基条件下发酵并对抑菌能力进行检测，所形成的抑菌圈直径是24.76 mm是优化前的1.25倍。

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Optimization of propionin production by Response Surface Method

WANG Hai-jing1,WANG Yu-hua1,QI Bin2,3
(1.School of Food Science and Engineering,Jilin Agricultural University,Changchun 130118，China；2.School of Biotechnology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500，China；3.The Key Laboratory of Food and Biotechnology,Changshu 215500，China)

Fermentation process were optimized by using Response Surface Analysis method,the fermentation medium and the cultural conditions can be Examined and evaluated,optimal levels of the variables also can be defined,then the Fermentated activity can beimproved,the fermentation medium for propionin production was optimized by this methed in order to improve the inhibitory activity of propionin.Firstly,three statistically significant parameters including glucose,tween80,pH were identified by Plackett-Burman design.The optimal levels of three variables were defined by Steepest ascent method and Response surface method(RSM):glucose 2.32 g/L,tween80 0.1 g/L,pH 7.0.The inhibitory activity under the optimal fermentation medium can be improved.The diameter of inhibition zone was 24.76 mm,which was as 1.25 times as that under the original fermentation medium.

propionin;Plackett-Burman(PB);steepest ascent;Response Surface Method(RSM)

Q93.335

A

1001-2230（2011）02-0013-04

2010-09-30

苏州市科学技术局资助项目（SNG0925），江苏省“六大人才高峰”项目资助。

王海晶(1985-)，女，硕士研究生，食品微生物和功能性食品。

齐斌