真姬菇菌丝体液体发酵富锌条件的优化

冮 洁，金京慧

(大连民族学院生命科学学院，辽宁大连116600)

真姬菇菌丝体液体发酵富锌条件的优化

冮 洁，金京慧

(大连民族学院生命科学学院，辽宁大连116600)

通过液体发酵技术对真姬菇菌丝体富锌条件进行了优化。结果表明:真姬菇菌丝体具有较强的耐锌能力和富锌能力，在300～700mg/L的锌浓度范围内都可以生长。菌丝体对锌的最适富集浓度为400mg/L，并且对富集的锌有机化程度较高。真姬菇菌丝体最优富锌条件为:在发酵温度28℃，起始pH 6，振荡转速150r/min，250mL三角瓶装液50mL，接种量5%(V∶V)时培养6d，真姬菇菌丝体富锌率为最高，可达7.98%，且该组的有机锌的富集率为4.90%。

真姬菇，富集锌，液体发酵，菌丝体

真姬菇(Hypsizigus marmorens)又名玉蕈、斑玉蕈、蟹味菇等，是一种珍稀食用菌。它隶属担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，白蘑科，玉蕈属。自然分布于欧洲、北美、西伯利亚和日本等地［1］。采用液体深层发酵技术培养真姬菇菌丝体，不受环境因素的影响，易控制，效率高，价格便宜，适合工业化生产。并且深层发酵培养的真菌菌丝体与子实体在化学组成、生理功能上均很相似［2－3］。锌是人体必需的微量元素之一，是许多金属酶的组成成分或酶的激活剂。锌缺乏在中国人群中普遍存在，婴儿、儿童、孕妇和育龄妇女缺锌尤其严重［4］。食品中以游离态存在的锌不易被人体吸收，且一般游离态的金属均具有一定毒性。因为富锌食用菌中的锌较无机锌更安全无毒且利用率高，所以多用于制造补锌的药物与产品，如口服液、药片等。也有创新产品的研制，如富锌灵芝枇杷保健冰激凌［5］。富锌食用菌的产品无论从种类还是数量上都很少，还处于起步阶段。刘坤等对姬松茸菌丝进行了富集锌的研究［6］。邓百万等进行了猪苓菌丝液体培养及富锌研究，在液体深层培养基中加入无机锌盐，猪苓有显著吸附作用并形成有机锌［7］。张琪林等对大球盖菇富锌特性进行了研究，得出培养基中硫酸锌的添加量应以385mg/kg为宜，在此浓度，菌丝锌含量可达24.243mg/kg，虽然不是很高，但都是有机锌，有利于人体吸收［8］。本文对真姬菇菌丝体富锌能力进行了考察，并对其液体发酵富锌的适宜条件进行了优化，为真姬菇菌丝体的进一步广泛应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

真姬菇(Hypsizigus marmoreus) 购自朝阳市食用菌研究所;斜面和固体平板培养基(综合PDA培养基) 马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾1.5g、硫酸镁1.0g、琼脂粉20g、水1000mL，自然pH;液体培养基 不加琼脂的综合PDA培养基;葡萄糖、琼脂粉、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锌 以上试剂均为分析纯或化学纯。

电子精密天平，电热恒温培养箱，无菌操作台，紫外可见分光光度计，恒低温气浴摇床，pH酸度计，智能水分测定仪等。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种活化 将保存菌种用接种针接入斜面培养基中，25℃恒温培养10d。

1.2.2 菌丝体培养

1.2.2.1 液体菌种培养 将活化的菌种接种在装有100mL不加琼脂的液体PDA综合培养基的250mL三角瓶中，接种量为10%，置28℃，150r/min恒温振荡培养10d。

1.2.2.2 富锌发酵培养 将液体菌种接入装100mL发酵培养基的三角瓶中，接种量为10%，分别加入终浓度为0、300、400、500、600、700、800mg/L的ZnSO4母液，28℃，150r/min振荡培养10d。

1.2.3 菌丝体锌含量的测定 采用双硫腙分光光度法测定［9］。实验数据取三次实验结果的平均值。

1.2.4 菌丝体生物量的测定 取10mL发酵液于5000r/min离心20min，蒸馏水洗涤3次，60℃烘至恒重，分析天平称重。

1.2.5 菌丝体富锌有机化程度的分析 在液体培养富锌能力的实验样品中，抽取硫酸锌浓度为400mg/L与500mg/L的样品检测有机化程度。将菌丝体放入去离子水中不断离心洗涤直至上清液澄清，检测上清液与菌丝体中的含锌量。

1.2.6 富锌率的计算

富锌率(%)=［富锌菌丝体含量(μg/g)－空白菌丝体锌含量(μg/g)］×富锌菌丝体干重(g/100mL)/培养基内锌含量(μg/100mL)×100%

2 结果与讨论

2.1 真姬菇菌丝体固体培养耐锌能力的实验结果

将真姬菇接种到含不同浓度锌的固体平板培养基上培养，考察菌丝生长情况。

结果如图1所示，通过测定菌落直径可以看出，锌浓度为300～400mg/L时有明显的促进菌丝生长的作用;当锌浓度大于700mg/L时，菌丝体生长下降。通过测定菌丝萌发时间可以看出，锌浓度为400～600mg/L时，菌丝萌发需要时间较短，锌的添加有促进菌丝萌发的作用。

图1 真姬菇菌丝体固体培养耐锌能力实验

2.2 真姬菇液体培养耐锌能力的实验结果

根据耐锌平板培养的结果，设定真姬菇耐锌浓度在0～800mg/L，分别配制硫酸锌浓度为0、300、400、500、600、700、800mg/L的液体培养基，进行液体发酵培养10d，测定菌丝体含锌量，结果见表1。

表1 真姬菇液体培养耐锌能力实验

从表1可以看出，当锌浓度为400mg/L时，对菌丝体生长有明显促进作用，高于400mg/L则起到抑制作用，当锌浓度为800mg/L时，菌丝体几乎没有生长。菌丝体含锌量的最高值出现在锌浓度为500mg/L时，富锌率的最高值出现于400mg/L。分别选择锌浓度为400mg/L和500mg/L培养的菌丝体做锌有机化程度实验。

2.3 富锌有机化程度的比较与分析

除去菌丝体上粘附的培养基中的ZnSO4和菌丝体中的无机锌，测定有机锌的含量，实验结果如表2所示。

表2 真姬菇菌丝体富锌有机化程度的比较

从表2可以看出，虽然锌浓度为400mg/L的菌丝体的富锌率最高，但是500mg/L的真姬菇菌丝体的有机化程度要比锌浓度400mg/L真姬菇菌丝体的有机化高。培养基中的无机锌是通过与菌丝体中的蛋白质、多糖等大分子结合而形成有机锌的。当锌浓度是400mg/L时真姬菇菌丝体有机锌的富集率高于锌浓度是500mg/L时有机锌的富集率。因此，选择400mg/L作为下一步实验锌添加浓度。

2.4 真姬菇液体发酵富锌条件的优化

采用四因素三水平正交实验，研究装液量、接种量、pH、培养时间对真姬菇富锌的影响。正交实验因素水平见表3，实验结果如表4所示。

表3 正交实验因素水平表

表4 正交实验结果表

由表4可知，以富锌率为目标值的实验因素影响的主次顺序为:A(装液量)>B(接种量)>D(培养时间)>C(pH)。最优组合为:A1B1C1D1，即装液量50mL、接种量5%、pH6、培养时间6d，是正交实验表中第1组实验，富锌率最大，为7.98%，其中该组别的有机锌的富集率为4.90%。

对正交实验结果进行方差分析(表5)可知，因素A(装液量)对真姬菇菌丝体富锌的影响具有显著性。

表5 正交实验结果方差分析表

3 结论

通过液体发酵技术对真姬菇菌丝体进行富锌，结果表明:真姬菇菌丝体具有较强的耐锌能力和富锌能力，在300～700mg/L的锌浓度范围内都可以生长。菌丝体对锌的最适富集浓度为400mg/L，并且对富集的锌有机化程度较高，最大富锌率可达7.98%，该组的有机锌的富集率为4.90%。

本文采用ZnSO4作为真姬菇富锌的锌源，不同的锌源对食用菌菌丝体富锌会产生不同的影响。根据黄仁术等人的研究结果液体培养金针菇富锌Zn(CH3COO)2作为锌源要比ZnSO4、ZnCl2利用率高。因为Zn(CH3COO)2是弱酸弱碱盐，它可以使菌丝与锌在适宜的、稳定的环境中络合和生长［10］。培养基中的无机锌是通过与菌丝体中的蛋白质、多糖等大分子结合而形成有机锌的。

［1］张俊刚.真姬菇功能食品抗疲劳研究［J］.安徽农业科学，2008，36(19):8141－8142.

［2］李娟，王臻，姚良同，等.真姬菇多糖研究进展［J］.微生物学杂志，2005，25(4):89－91.

［3］邓超，邬敏辰.食用菌深层发酵及其多糖活性研究进展［J］.安徽农业科学，2007，35(15):4622－4625.

［4］秦义.富锌灵芝液体种子培养条件的优化［J］.西北农业学报，2007，16(1):153－156.

［5］张红兵.富锌灵芝枇杷保健冰激凌的研制［J］.冷饮与速冻食品工业，2006，12(2):13－18.

［6］刘坤，沈卫，章克昌.姬松茸深层发酵富集锌的研究［J］.食品与发酵工业，2005，31(4):84－86.

［7］邓百万，陈文强.猪苓菌丝液体培养及富锌研究［J］.中国食用菌，2002(22):33－34.

［8］张琪林，王红.大球盖菇液体培养富锌特性研究［J］.农业与技术，2007，27(5):58－59.

［9］无锡轻工业大学，天津轻工业学院.食品分析［M］.北京:中国轻工业出版社，2005:313－318.

［10］黄仁术.液体培养富锌金针菇锌源与锌添加量的研究［J］.食品与发酵工业，2007，33(12):48－51.

Optimization of mycelium liquid fermentation conditions of Zinc－riching of Hypsizigus marmoreus

GANG Jie，JIN Jing－hui(
College of Life Sciences，Dalian Nationalities University，Dalian 116600，China)

The mycelium liquid fermentation conditions of Zinc－riching of Hypsizigus marmoreus were studied.The results showed that Hypsizigus marmoreus mycelium had the capacities of Zn－resisting and Zn－accumulating.The strain could grow in the medium with Zinc concentration from 300mg/L to 700mg/L.When Zinc added to the liquid medium was 400mg/L，the mycelium had the most Zinc absorbance and better Zinc organic.The optimum Zincriching liquid fermentation conditions were as following:fermentation temperature 28℃，pH 6，stirring speed 150r/min，250mL shake flash containing 50mL，inoculation size 5%(V∶V)for 6d.Under the conditions，the ratio of Zn－accumulation reached a maximum of 7.98%，the degree of this group Zinc organic was 4.90%.

Hypsizigus marmoreus;Zinc－riching;liquid fermentation;mycelium

TS201.3

A

1002－0306(2011)06－0226－03

2010－07－07

冮洁(1965－)，女，博士，研究方向:食品生物技术。

大连民族学院自主基金(财政专项－中央高校基本科研业务费)项目(DC10020106)。