枳实、枳壳中辛弗林含量比较分析

黄伟，刘友平，赵祎姗，施学骄，张杰红，彭月

枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L．及其栽培变种或甜橙 C．sinensis Osbeck的干燥幼果［1］;目前，市场上销售的枳实主流品种为酸橙枳实［2－3］。枳壳为芸香科植物酸橙C．aurantium L．及其栽培变种的干燥未成熟果实［1］。现代研究表明枳实、枳壳类药材中富含生物碱类成分，主要有脱氧肾上腺素(即对羟基福林，又名辛弗林(Synephfine))、乙酰去甲辛弗林(又名乙酰真蛸胺(N－aeetyloetopamine))、N－甲基酪胺(N－methyltyramine)、去甲肾上腺素(Noradrenaline)，喹诺啉(Qinoline)、那可汀(Nareotine)等［4］，其中以辛弗林、N－甲基酪胺含量较高。辛弗林是间接β－肾上腺素激动剂，它具有强心、增加心输出量、改善心泵血功能及提高外周阻力、升高血压的作用［5－8］;其化学结构和麻黄碱近似，意大利学者通过动物实验证实辛弗林对人的身体健康存在潜在威胁，其毒副作用引人关注。枳实、枳壳药材中辛弗林是其升压作用的功效成分，但关于其质量控制方面的研究较少，特别是枳壳中辛弗林的质量控制急待研究。因此如何在保证药效的前提下，制定该类药材的标准，确保临床用药安全有效值得进一步研究。本文对枳实、枳壳中辛弗林含量进行比较研究，以期为二者的质量控制和临床用药提供现代科学参考依据。

1 仪器与试药

1．1 仪器

岛津LC－10ATVP高效液相色谱仪(日本岛津公司)，CLASS－VP工作站;紫外－可见分光光度计(上海天美科学仪器有限公司UV1100型);BP211D(十万分之一)，BP121S(万分之一)型电子分析天平(德国Sartorius公司)。

1．2 试剂

辛弗林对照品(中国药品生物制品检定所提供，供含量测定用，批号0727－200004)，乙腈为色谱纯(国药集团化学试剂有限公司)，水为高纯水，其余试剂为分析纯。

1．3 样品

枳实、枳壳药材均由成都中医药大学标本馆卢先明教授鉴定，鉴定结果、样品采集时间、采集地及产地见表1。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

大连依利特BDS C18色谱柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流动相乙腈－磷酸水(取十二烷基硫酸钠0.5 g，0.5 mL磷酸加水溶解并稀释至500 mL，加入5 mmol·L－1三乙胺调pH值至2.5)(50:50)，流速1.0 mL·min－1，柱温30℃，检测波长225 nm。在上述条件下，辛弗林色谱峰能完全分离，色谱图见图1。以辛弗林峰计算理论板数不低于3000。

图1 图中A为样品，B为辛弗林对照品

2.2 供试品溶液的制备

取样品粗粉1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，加热回流1.5 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密取续滤液10 mL，蒸干，残渣加水10 mL使溶解，通过聚酰胺(60－90 目，2.5 g，内径为1.5 cm，干法装柱)，用水25 mL洗脱，收集洗脱液，转移至25 mL容量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

2.3 对照品溶液的制备

取辛弗林对照品适量，精密称定，加甲醇配制成浓度为 0.188 mg·mL－1的溶液，即得。

2.4 测定波长的选择

取辛弗林对照品溶液在200～400nm波长范围进行扫描，在225 nm处有最大吸收峰，故选择225 nm作为检测波长。

2.5 线性关系的考察

精密吸取“2.1.3”项下对照品溶液 2、6、10、12、16 μl注入液相色谱仪，测定峰面积。以峰面积积分值(y)为纵坐标，质量(x)为横坐标进行线性回归，得y=50522x－8041.6(R=0.9998)，结果表明:辛弗林的进样量在0.376 mg～3.384 mg范围内与各自的峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.6 精密度试验

取同一份供试品溶液，连续进样6次，记录色谱流出信号。以辛弗林含量为考察对象，计算6次分析所得辛弗林含量，RSD小于0.5%。

2.7 稳定性试验

取 S－1 号样品供试品溶液，分别于 0，2，4，6，8，12 h测定辛弗林含量，结果辛弗林的RSD为1.28%。表明供试品溶液在12h内稳定性良好。

2.8 重现性试验

取同一批号药材，按供试品方法制备供试品溶液6份，记录色谱流出信号，计算6份样品中辛弗林含量，RSD小于1.0%。

2.9 回收率试验

取K－1号药材粉末约0.25 g(含辛弗林1.65 mg)6份，精密称定。各份中加入辛弗林对照品溶液10 mL(含辛弗林1.88 mg)，按“2.2”项下供试品制备方法制备样品，测定辛弗林含量，计算回收率。所得回收率分别为 99.1%、99.8%、100.8%、99.0%、100.9% 和102.7%，RSD为1.4%。

2.10 样品含量测定

分别取供试品溶液及辛弗林对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪测定，记录峰面积，按外标一点法计算样品中辛弗林含量，结果见表1。

表1 枳实、枳壳样品收集与辛弗林含量测定结果(n=2)

3 结果与讨论

3.1 本实验参考文献报道以及药典对枳实生物碱的纯化方法，在枳壳样品的处理上也通过聚酰胺进行了处理，在处理后枳壳中生物碱能够得到很好的分离和富集。辛弗林为有机胺类生物碱，极性较大，用普通的色谱法无法达到良好的分离。因此采用离子对反相高效液相色谱法对其进行分离，流动相中加入十二烷基硫酸钠、三乙胺作为离子对试剂，能达到良好的分离效果［9－10］。我们发现辛弗林在乙腈－磷酸水(取十二烷基硫酸钠0.5 g，0.5 mL磷酸加水溶解并稀释至500 mL，加入5 mmol·L－1三乙胺调 pH 值至2.5)(50:50)作为流动相时，与相邻组分的分离度达到分离要求，能完全满足色谱峰定量要求。

3.2 含量测定结果表明所测枳实样品中辛弗林含量变化范围为0.28% ～2.53%，平均含量为1.1%;枳壳样品中辛弗林含量变化范围为0.10% ～1.10%，平均含量为0.58%，枳实中辛弗林含量明显高于枳壳。不同批次、产地枳实和枳壳间辛弗林含量差异较大，所测枳实、枳壳样品中辛弗林含量高者是辛弗林含量低者的10倍多，如:购于四川省西南药都药材市场的S－1枳实样品辛弗林含量为2.53%，S－2枳实样品辛弗林含量为0.28%;购于四川省西南药都K－2枳壳样品辛弗林含量为1.12%，重庆璧山自采K－6枳壳样品辛弗林含量为0.1%。不同采收期的枳壳样品中辛弗林含量差异也较大，如:荣昌种植基地K－7枳壳10月份自采样品中辛弗林的含量0.25%低于荣昌种植基地K－3枳壳8月份自采样中辛弗林的含量0.45%。以上结果表明:不同批次、产地和不同采收时期的枳实、枳壳样品中辛弗林含量差异均较大。目前枳壳中还未建立辛弗林的控制指标，因而枳壳中辛弗林的质量标准急待建立。本文对枳实、枳壳药材中辛弗林含量进行比较分析，以期为制定该类药材的质量标准提供现代科学依据。

3.3 辛弗林其化学结构近似麻黄碱，其毒副作用已有学者报道，该毒副作用应该引起重视。枳实、枳壳中均含有辛弗林，而且该类药材中辛弗林的含量差异较大，含量高者可达2.53%，含量低者只有0.1%，因而在建立该类药材的质量标准时应同时考虑辛弗林的临床疗效和毒副作用。本文的研究结果，对该类药材安全有效的临床应用具有参考价值。

［1］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)［S］．北京:中国医药科技出版社，2010:229．

［2］ 李劲松．枳实的研究概况［J］．福建中医学院学报，2005，［3］ 10(15):51．

［3］ 蔡逸平，陈有根，范崔生．中药枳壳、枳实类原植物调查及商药材的鉴定［J］．中国中药杂志，1999，24(5):259．

［4］ 蔡逸平，曹岚，范崔生．枳壳类药材化学成分研究简报［J］．江西中医药，1998，29(6):46．

［5］ 戴汉云，熊正东．化学合成枳实有效成分对羟福林N－甲基酪胺临床资料总结［J］．中国药学杂志，1989，10(2):612．

［6］ 阎应举．枳壳与枳实的药理研究(第1、2次报告)．对肠管、子宫的作用．对血压、肾容积、心脏、血管、泌尿及支气管的作用［J］．中华医学杂志，1955，8(5):433．

［7］ 胡盛珊，王大元，邱萍，等．枳实有效成分的药理活性比较［J］．中草药，1994，25(8):419．

［8］ 李红芳，李丹明，瞿颂义，等．枳实和陈皮对兔离体主动脉平滑肌条作用机理探讨［J］．中成药，200l，23(9):659．

［9］ 王国荣．薄层扫描法测定酸橙枳实(壳)中辛弗林和N－甲基酪胺的含量［J］．药物分析杂志，1994，14(4):48．

［10］贾晓斌．HPLC测定苏州地区陈皮中辛弗林含量［J］．南京中医药大学学报，1999，15(1):27．