皮状丝孢酵母B3利用木薯淀粉发酵生产微生物油脂

袁锦云，艾佐佐，张志斌，颜日明，曾庆桂，朱笃

1 江西师范大学生命科学学院 江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室，南昌 330022

2 宜春学院 江西省天然药物活性成分研究重点实验室，宜春 336000

皮状丝孢酵母B3利用木薯淀粉发酵生产微生物油脂

袁锦云1,2，艾佐佐1，张志斌1，颜日明1，曾庆桂1，朱笃1,2

1 江西师范大学生命科学学院 江西省亚热带植物资源保护与利用重点实验室，南昌 330022

2 宜春学院 江西省天然药物活性成分研究重点实验室，宜春 336000

对皮状丝孢酵母B3以木薯淀粉水解液为碳源发酵生产微生物油脂培养条件进行了优化，并在2 L发酵罐中对菌体生长和油脂积累进行了考察。摇瓶实验表明，木薯淀粉水解液的浓度高于90 g/L时不利于菌体的生长和油脂积累，皮状丝孢酵母B3发酵生产微生物油脂的最适氮源及其浓度、最适C/N比和pH分别为酵母提取物3.0 g/L、116、6.0，在此条件下培养144 h菌体生物量、油脂产量和油脂含量分别达到15.2 g/L、6.22 g/L和40.9%；在2 L发酵罐中分批发酵44 h后菌体生物量、油脂产量和油脂含量分别达28.7 g/L、12.27 g/L和42.8%。以皮状丝孢酵母B3所产油脂制备生物柴油，其主要组成包括棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯等，且理化特性符合相关国家标准，可作为一种有潜力的化石燃料替代品。

皮状丝孢酵母B3，木薯淀粉，微生物油脂，生物柴油

Abstract:Microbial oil, as raw material for biodiesel, can be produced by Trichosporon cutaneum B3 using cassava starch hydrolysate. Batch cultures demonstrated that there was little inhibitory effect with the concentration of cassava starch hydrolysate up to 90 g/L. The favorable initial pH, C/N molar ratio, nitrogen source and its concentration were 6.0, 116, yeast extract and 3.0 g/L, respectively. Under the optimized conditions, dry biomass reached 15.2 g/L and lipid content reached 40.9%after culture for 144 h in flask. Batch cultures in a 2 L stirred-tank fermenter were run for 44 h and resulted in dry biomass, lipid content and lipid yield of 28.7 g/L, 42.8% and 12.27 g/L, respectively. The chemical compositions of biodiesel prepared from lipids of T. cutaneum B3 mainly included palmitic acid methyl ester, stearic acid methyl ester, oleic acid methyl ester and linoleic acid methyl ester etc., and its main physicochemical properties were in compliance with relevant national diesel standards.Therefore, the biodiesel prepared from lipids of T. cutaneum B3 can serve as a potential fossil fuel alternatives.

Keywords:Trichosporon cutaneum B3, cassava starch, microbial oil, biodiesel

作为一种可替代化石燃料的可再生新能源，生物柴油已引起人们的广泛关注。迄今，生物柴油的制备主要以植物油脂为原料，存在原料短缺、生产成本高等问题，这严重制约了其产业化进程[1-2]。大部分微生物油脂的脂肪酸组成和一般植物油相近，且微生物具有细胞增殖快、生产周期短、生长所需的原料丰富等优点，因此微生物油脂发酵生产成为生物柴油产业和生物经济的重要研究方向[3]。由于微生物油脂发酵生产存在培养基原料成本高、油脂产率低等问题，导致微生物油脂用于制备生物柴油在经济上不可行。

寻找新的廉价而优质的微生物油脂发酵培养基原料，开发新的微生物油脂生产工艺，提高发酵过程中细胞生物量及油脂含量，从而降低生产成本成为目前研究重点。迄今，国内外已有不少利用工农业废弃物和可再生资源发酵生产微生物油脂的报道[4-6]。木薯作为非粮作物，不仅具有适应性强、生长快、产量大、可生长于山野荒地、不与粮食争地等优点[7]，而且木薯淀粉水解为还原糖的转化率高，成为发酵生产微生物油脂的良好候选原料。研究和开发以木薯淀粉为原料生产微生物油脂的发酵工艺，不仅能降低微生物油脂的生产成本，而且能增加农民的收入，带动地区经济发展，具有巨大的经济价值和良好的社会效益。

本研究选用本实验室经诱变选育获得的皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum B3为发酵菌株，以木薯淀粉水解液为碳源，进行了皮状丝孢酵母B3发酵产油脂的摇瓶培养条件优化，并考察了其在2 L发酵罐中培养的生长和油脂积累情况，分析了以其所产油脂制备的生物柴油的成分及主要理化性能，为利用皮状丝孢酵母 B3发酵微生物油脂进而合成生物柴油奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 木薯淀粉样品

木薯淀粉购自广西武鸣县恒星淀粉厂。

1.1.2 发酵菌种

皮状丝孢酵母 B3由本实验室筛选并经诱变选育而得。

1.1.3 培养基

固体培养基：葡萄糖：70 g/L；酵母提取物：1 g/L；NH4NO3：0.5 g/L；KH2PO4：0.75 g/L；CaCl2·2H2O：0.4 g/L；MgSO4·7H2O：0.4 g/L；琼脂：20 g/L；pH 6.0。

种子培养基：葡萄糖：70 g/L；酵母提取物：1 g/L；NH4NO3：0.5 g/L；KH2PO4：0.75 g/L；CaCl2·2H2O：0.4 g/L；MgSO4·7H2O：0.4 g/L；初始pH 6.0。

摇瓶发酵培养基：以不同浓度木薯淀粉水解液(其浓度以其含还原糖浓度计，下同) 为碳源，根据实验需要选择不同的氮源及初始pH；KH2PO4：1.5 g/L；CaCl2·2H2O：0.4 g/L；MgSO4·7H2O：0.4 g/L。

2 L发酵罐培养基：木薯淀粉水解液60 g/L，酵母提取物3 g/L，其他营养盐成分和含量与摇瓶相同。

1.2 实验方法

1.2.1 木薯淀粉水解液的制备

称取适量木薯淀粉，加入适量冷水调匀后将pH调节至 7.0，再加入适量 90 ℃~100 ℃的热水使其糊化，加入 α-淀粉酶 (北京东华强盛生物技术有限公司，酶活：4 000 U/g，α-淀粉酶加量：10 U/g木薯淀粉干重)，搅匀后88 ℃水浴40 min；冷却后将pH调节至5.5，加入糖化酶 (张家港市金源生物化工有限公司，酶活：100 000 U/g，糖化酶加量：1 000 U/g木薯淀粉干重)，搅匀后65 ℃水浴40 min。4 000 r/min离心10 min，上清液至于4 ℃保存备用。

1.2.2 生物量的测定

浊度法：取发酵液，测定其在600 nm下的光密度值 (OD600) 以此衡量菌体相对生长量。

干重法：收集稳定期的发酵液，4 000 r/min离心10 min，蒸馏水洗涤菌体1~2次后取沉淀，60 ℃烘至恒重，称重。

1.2.3 发酵液中还原糖、总糖及氨基氮的测定

还原糖的测定：采用斐林试剂法[8]。

总糖的测定：取1 mL经离心后的发酵液上清，加入6 mol/L的盐酸5 mL，微沸10 min，用6 mol/L的 NaOH溶液调节pH至中性。其后步骤同还原糖的测定。

氨基氮含量测定：采用甲醛滴定法测定[9]。

1.2.4 微生物油脂的提取

油脂提取及测定：采用索氏提取法。将烘干后的菌体研成粉末后装入索氏提取器，石油醚加热回流提取8 h，旋转蒸发去除石油醚，真空干燥至恒重即得油脂，称重[10]。

1.2.5 生物柴油的制备、组成及理化性能分析

生物柴油的制备：取微生物油脂200 mg，加0.4 mo1/L的KOH-甲醇溶液5 mL和正己烷5 mL，剧烈振荡3 min，在30 ℃水浴中放置4 h，加水5 mL，静置分层，取正己烷层，真空干燥至恒重即得生物柴油，称重[11]。

脂肪酸甲酯成分测定：采用气相色谱法进行成分分析，参照GB/T 17377-2008[12]。

生物柴油的理化性能分析：密度测定参照GB/T 1884-2000[13]；运动粘度测定参照 GB/T 265-1988[14]；闪点测定参照GB/T 261-1983[15]；酸值测定参照GB/T 264-1983[16]；硫含量测定参照 GB/T 380-1977[17]；十六烷值测定参照GB/T 386-1991[18]。

1.2.6 培养条件

摇瓶培养：在250 mL锥形瓶中进行，装液量为75 mL，5%的接种量，摇床转速为200 r/min，培养温度为28 ℃。

发酵罐培养：采用2 L发酵罐 (德国B. Braun)，装液量为1.3 L，5%的接种量，培养温度为28 ℃，通气量1 vvm，发酵过程中用NaOH溶液调节pH 6.0，改变转速以控制溶氧在10%以上。

2 结果与分析

2.1 不同初始浓度木薯淀粉水解液对T. cutaneum B3生长和油脂产量的影响

微生物油脂的合成需要以培养基中的碳源物质作为原料，但是过高的碳源浓度又会对菌体的生长产生抑制作用。为研究不同初始浓度的木薯淀粉水解液对T. cutaneum B3生长的影响，在发酵培养基中分别添加了10~300 g/L的木薯淀粉水解液，考察T. cutaneum B3在不同初始浓度木薯淀粉水解液培养基中的生长情况。

在木薯淀粉水解液的初始浓度低于90 g/L的培养基中，菌体前24 h的长势大致相同。但是当发酵培养基中木薯淀粉水解液的初始浓度高于 90 g/L时，菌体的生长明显受到了抑制。而木薯淀粉水解液的初始浓度在30~90 g/L范围内，其生长速率变化不大，这说明T. cutaneum B3对不同浓度的木薯淀粉水解液有一个较大的生长适宜范围 (图1)。T. cutaneum B3在不同初始浓度木薯淀粉水解液的培养基中培养144 h的摇瓶发酵数据见表1。当发酵培养基中的初始木薯淀粉水解液浓度从10 g/L增加至80 g/L时，生物量和油脂产量分别从1.4 g/L和0.28 g/L增至15.6 g/L和6.66 g/L。发酵培养基中的初始木薯淀粉水解液浓度为90 g/L时，尽管油脂含量提高至 45.3%，但是生物量和油脂产量分别下降到13.1 g/L和5.93 g/L，当发酵培养基中的初始木薯淀粉水解液浓度进一步提高至150 g/L时，生物量和油脂产量仅为6.9 g/L和2.75 g/L。发酵培养基中的初始木薯淀粉水解液浓度高于90 g/L，生物量和油脂产量下降，说明过高的基质浓度对T. cutaneum B3的生长和油脂积累均有不利影响。导致这种现象的原因可能有两方面：一是过高的基质浓度产生的高渗透压抑制了菌体的生长[6,19]，二是过高的糖浓度会使代谢产生的有机酸大量累积，导致发酵液的pH值降低，从而不利于菌体的生长和脂肪的合成[20]。此外，从培养基中糖的利用率来看，当发酵培养基中的初始木薯淀粉水解液浓度低于50 g/L时，虽然糖的利用率均在90%以上，但生物量和油脂产量没有达到最佳。综合考虑生物量、油脂含量、油脂产量、糖的利用率和油脂得率等因素，选取60 g/L为后续摇瓶实验培养基中木薯淀粉水解液的浓度。

图1 木薯淀粉水解液浓度对T. cutaneum B3生长的影响Fig. 1 Effect of cassava starch hydrolysate concentration on the growth of T. cutaneum B3.

表1 T. cutaneum B3在不同初始浓度木薯淀粉水解液中的生物量和油脂产量Table 1 Effect of initial cassava starch hydrolysate concentration on cell growth and lipid accumulation of T. cutaneum B3

2.2 不同氮源浓度对T. cutaneum B3生长和油脂产量的影响

通过对不同氮源 (包括 KNO3、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)2SO4、牛肉膏、酵母提取物、蛋白胨) 的筛选，结果表明酵母提取物为T. cutaneum B3生长和油脂积累的最适氮源 (数据未列出)。

培养基中氮源的浓度对产油菌体的生长和油脂积累有着很大的影响，氮源是菌体生长所必须的，但是过量的氮源又不利于菌体中油脂的积累，因此在微生物油脂发酵中控制碳源和氮源的使用比例十分重要[6,20]。研究结果表明，低浓度的有机氮源有利于菌体中油脂的积累，但是不利于生物量的提高。当酵母提取物的浓度为4.0 g/L时，生物量达到最大值16.4 g/L，但是其油脂含量仅为31.6%。当酵母提取物的浓度为3.0 g/L时，虽然获得的生物量15.4 g/L和油脂含量 38.7%均不是最高值，但是获得了最高的油脂产量5.97 g/L，此时的C/N比为116。当C/N比从36提高至345，菌体内油脂含量随C/N比的提高而增加，但当C/N比提高至687时油脂含量出现了轻微的下降。同时，当酵母提取物的浓度低于4.0 g/L时，生物量随着酵母提取物浓度的提高而增加，但是当酵母提取物的浓度高于4.0 g/L时生物量反而下降 (表2)。实验中观察到在高浓度的有机氮源的培养基中T. cutaneum B3的菌丝较长，致使培养液非常粘稠，严重影响溶氧从而抑制了菌体的生长。

表2 不同酵母提取物浓度对T. cutaneum B3生长和油脂积累的影响Table 2 Effect of yeast extract concentration on cell growth and lipid accumulation of T. cutaneum B3a

虽然酵母提取物为T. cutaneum B3生长和油脂积累的最适氮源，但由于使用该氮源存在生产成本较高的问题，无法应用于工业化生产，而廉价的无机氮源又不能有效促进菌体生长和油脂的形成，因此寻找更为廉价的有机氮源势在必行。为此，我们考察了提取油脂后的废弃细胞代替氮源的可行性。结果表明，在总氮含量为0.50 g/L废弃细胞酶解液中补加1.0 g/L的酵母提取物不仅可完全代替3.0 g/L酵母提取物，而且还能提高油脂产量 33.7% (结果另文发表)；此外，探讨废弃细胞酶解液补加黄豆饼粉、玉米浆等较为廉价的有机氮源完全代替酵母提取物的研究正在进行之中。

2.3 初始pH对T. cutaneum B3生长和油脂积累的影响

培养基pH值会直接影响到细胞膜的渗透性，从而影响菌体对培养基中离子的吸收和利用，并最终影响菌体对碳源的利用效率[6,21]，因此控制发酵培养基pH的稳定成为提高生物量和油脂产量的关键。不同初始pH对T. cutaneum B3生物量和油脂含量的影响结果见表3。当培养基的初始pH为6.0时，生物量和油脂产量分别为15.2 g/L和6.22 g/L，均高于其他初始 pH的生物量和油脂产量；当培养基的初始pH处于5.5~7.0之间时，培养144 h后所得的生物量和油脂产量相差并不大。

2.4 2 L发酵罐中的分批发酵

为考察T. cutaneum B3在2 L发酵罐中的菌体生长、油脂积累、基质消耗等情况，摇瓶发酵得出的结果被用于T. cutaneum B3在2 L发酵罐中的放大实验。从图2可知，培养44 h后生物量达到28.7 g/L，油脂产量达到12.27 g/L，油脂含量为42.8%。与摇瓶相比，T. cutaneum B3在2 L发酵罐中的生物量提高了88.8%，菌体含油量增加了1.9%，油脂产量提高了 97.3%，发酵周期也大幅度缩短 (由摇瓶的144 h缩短至44 h)。这主要是由于发酵罐较之摇瓶能够提供更好的混合和供氧条件以及稳定的 pH环境，有利于菌体生长以及产物合成潜力的有效发挥。此外，在发酵过程中，菌体的含油量从接种时的19.1%逐渐上升至 44 h的 42.8% (图 2)，这表明T. cutaneum B3油脂含量的高低与细胞生长密切相关。因此在后续的研究中，采用补料分批培养方法适当地补充碳源和氮源，延长发酵时间，将有可能增加菌体生物量和含油量，从而提高油脂产量。

图2 利用T. cutaneum B3在2 L发酵罐中生产微生物油脂Fig. 2 Prof i le of lipid production by T. cutaneum B3 in a 2 L fermenter.

表3 不同初始pH对T. cutaneum B3生长和油脂积累的影响Table 3 Effect of initial pH on cell growth and lipidaccumulation of T. cutaneum B3

表4 利用T. cutaneum B3所产油脂生产的生物柴油成分Table 4 Components of biodiesel produced from T.cutaneum B3 using cassava starch hydrolysate

2.5 生物柴油组成及理化性能分析

以T. cutaneum B3微生物油脂为原料制备生物柴油，所得生物柴油中酯含量超过99%。所制备的生物柴油组成主要包括棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯等，质量分数分别为20.92%、13.34%、53.48%、8.23%，这些组成成分的含量达到所合成生物柴油总量的96% (表4)，且所制备的生物柴油的密度、黏度、闪点、酸值、硫含量、十六烷值均符合柴油机燃料调和用生物柴油 (BD100)国家标准[22](表5)。以上数据表明，利用T. cutaneum B3以木薯淀粉水解液为碳源发酵所产油脂制备的生物柴油可作为一种有潜力的化石燃料替代品。

表5 微生物油脂生物柴油主要理化性能分析Table 5 Main properties of biodiesel from microbial oil

3 结论

本实验优化了T. cutaneum B3以木薯淀粉水解液为碳源生产微生物油脂的发酵条件，探讨了不同基质浓度和pH值对其生物量、油脂产量的影响，研究了其在2 L发酵罐中的生长和油脂积累过程。结果表明，当木薯淀粉水解液的浓度高于90 g/L时不利于T. cutaneum B3的生长和油脂积累；T. cutaneum B3发酵生产微生物油脂的最适氮源及其浓度、最适C/N比和pH分别为酵母提取物3.0 g/L、116、pH 6.0，在此条件下发酵144 h，其生物量、油脂产量和油脂含量分别达到15.2 g/L、6.22 g/L和40.9%。在2 L机械搅拌发酵罐中培养44 h，T. cutaneum B3生物量达到28.7 g/L，油脂产量达到12.27 g/L，油脂含量为42.8%。理化性能分析表明，以T. cutaneum B3所产油脂制备的生物柴油，完全符合柴油机燃料调和用生物柴油 (BD100) 国家标准，可作为一种有潜力的化石燃料替代品。

木薯淀粉作为一种产量大、价格便宜的可再生资源，用作发酵生产微生物油脂的培养基原料有着独特的优势。而且研究结果表明，提高T. cutaneum B3油脂的发酵产量可以从提高生物量和通过延长培养时间来提高菌体的油脂含量两方面着手，其油脂产量的提高仍有巨大的潜力。为提高以木薯淀粉为原料发酵生产微生物油脂的产量，本研究小组已经着手了补料分批式发酵生产微生物油脂工艺的研究。

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Microbial oil production by Trichosporon cutaneum B3 using cassava starch

Jinyun Yuan1,2, Zuozuo Ai1, Zhibin Zhang1, Riming Yan1, Qinggui Zeng1, and Du Zhu1,2
1 Key Laboratory of Protection and Utilization of Subtropic Plant Resources of Jiangxi Province, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China
2 Key Laboratory for Research on Active Ingredients in Natural Medicine of Jiangxi Province, Yichun University, Yichun 336000, China

Received: October 13, 2010; Accepted: February 18, 2011

Supported by: Academic and Technical Leaders Training Program for Major Subjects of Jiangxi Province.

Corresponding author: Du Zhu. Tel: +86-795-3200616; E-mail: zhudu12@163.com

江西省主要学科学术与技术带头人培养计划资助。