游离轻链检测对多发性骨髓瘤诊断的临床意义

翟玉华,梁玉芳,陈文明,王清涛

(1.首都医科大学附属北京朝阳医院检验科,北京100020;2.首都医科大学附属北京朝阳医院血液科)

多发性骨髓瘤(MM)是一种好发于中老年的单克隆浆细胞异常增生的恶性疾病。其发病率随年龄增长而增加。克隆性浆细胞病患者血清及尿中常出现游离轻链。其分子量小,合成速度略快于重链。在与重链结合后有部分轻链游离于血中,正常人维持在低浓度水平,而在多发性骨髓瘤时游离轻链大量增加。实验室常以本周氏蛋白阳性与否来判断是否有游离轻链。而本周氏蛋白(尿中游离轻链)检测受多种因素的影响[1](如患者的肾脏功能及尿量),而血清游离轻链在判断患者病情、监测疗效等方面优于尿轻链。该检测在国外已较广泛地应用于浆细胞增殖性的诊断和监测中,其检测的灵敏度高,特异强[2-4]。本实验室将以骨髓瘤患者为对象,评价几种常用检测方法,在诊断、疗效观察及预后判断中的应用前景。

1 材料与方法

1.1 样本 MM患者标本完整免疫球蛋白型29例(包括IgG、IgA 、IgD 型),轻链型21例,来自2006年6月-2008年11月我院及外院门诊及住院送检标本,临床明确诊断为多发性骨髓瘤患者均符合临床诊断标准。

1.2 试剂与仪器

美国BECKMAN公司1MMAGE双光径免疫分析仪和BECKMAN公司原装免疫球蛋白及轻链检测试剂;法国Sebia HYDRASYS全自动电泳仪及原装试剂,进行血清蛋白电泳,免疫固定电泳检测;英国Binding site公司Free Kap、Free Lam试剂。在美国BECKMAN公司 1MMAGE双光径免疫分析仪上检测。

1.3 方法

1.3.1 采集患者空腹不抗凝静脉血5 ml,2 500 r/min离心5分钟分离血清。用以上试剂及仪器以速率散射比浊法定量检测IgG、IgA、IgD及轻链Kappa、Lamda。

1.3.2 24小时尿标本混匀记尿量,送检10 ml。用以上试剂及仪器以速率散射比浊法定量检测尿中轻链Kappa、Lamda。比值明显异常且免疫固定电泳中与抗κ轻链或抗λ轻链血清形成致密浓染的沉淀带为本周阳性。

1.3.3 血清蛋白电泳:取10 μ l血清标本于加样梳在琼脂糖凝胶板上电泳,干燥,染色,脱色,烘干,扫描。在α 2-γ区可见单克隆区带为M成份检测阳性。

1.3.4 免疫固定电泳:血清标本的M蛋白浓度预稀释成1.5 g/l左右再进行IFE,取已稀释好10 μ l标本于加样梳在琼脂糖凝胶板上电泳后,依次加入固定剂 、抗 IgG 、抗 IgA 、抗IgM 、抗IgD,抗 κ轻链,抗 λ轻链血清各10 μ l。孵育固定沉淀蛋白,再吸去多余的抗血清,烘干,染色,脱色,烘干,观察结果。与抗体结合的免疫球蛋白将沉淀在凝胶中,其他蛋白可被洗去。再用酸性结晶紫或氨基黑染色后即可在凝胶上显现出不同型的免疫球蛋白及其相对含量。若有单克隆成份的免疫球蛋白存在时会在某一抗血清的泳道上形成致密浓染的沉淀带。

1.3.5 英国Binding site公司Free Kap、Free Lam试剂在BECKMAN公司1MMAGE双光径免疫分析仪上定量检测(严格按说明书要求操作)。血清检测结果判定参考区间:游离κ 8.9-25.5(mg/L)游离λ 12.5-33.6(mg/L)游离κ/λ0.49-1.07。游离κ/λ超出范围为阳性[1]。

2 结果

50例标本其中LCMM患者21例,IIMM患者29例(包括IgG、IgA及IgD型)。患者标本做血清免疫固定电泳轻链检测,尿轻链定量检测及血清游离轻链检测。对于21例LCMM患者,三种方法游离轻链阳性率分别为90.5%(19/21),80.9%(17/21),100%(21/21),对于29例IIMM患者游离轻链阳性率分别为 20.7%(6/29),41.4%(12/29),82.7%(24/29),见表1、表2、图1。(注:免疫固定电泳法是用血清免疫固定试剂而非本周氏免疫固定试剂)。

3 讨论

图1 血尿蛋白电泳区带,扫描图及免疫固定电泳图

表1 LCMM与IIMM血清IFE轻链检测、尿本周蛋白检测、血游离轻链检测结果

表2 IIMM患者血清IFE轻链检测、尿本周蛋白检测、血游离轻链检测结果

免疫球蛋白重链与轻链结合时,轻链分子量小,其合成速度略快于重链,在与重链组装成完整的免疫球蛋白分子后会有部分轻链游离于血液中,可自由通过肾小球滤过膜而被滤出。因此血清及尿中理论上都有少量的游离轻链(FLC,Free light chain)。以往的检测方法缺乏针对游离轻链特异的单克隆抗体因此受检测灵敏度限制低浓度游离轻链常常为阴性。目前检测血清FLC采用针对轻链上隐藏位点的多克隆抗体,特异结合FLC,特异性及灵敏性高,可检测低浓度的FLC。人类产κ轻链的浆细胞是产λ轻链的两倍。一般情况下κ以单体、λ以二聚体形式存在,肾脏对κ以单体滤过速度大约是λ二聚体的三倍,因此尽管κ的产量较λ的多,但血清中λ的浓度高于κ。多发性骨髓瘤(MM)是一种起源于前B细胞的骨髓浆细胞恶性增殖性疾病。其表现为骨髓中存在大量恶性浆细胞,这些细胞分泌大量的单克隆免疫球蛋白(M-蛋白),过量分泌且发生组装障碍,而出现重链和游离轻链大量并存的现象。

用检测血清游离轻链方法检测骨髓瘤患者伴随轻链可高达90%。尽管血清免疫固定电泳酸性结晶紫染色对单克隆免疫球蛋白的检出敏感性为25 mg/dl,能检测出非常少的单克隆成份,但在重链型多发性骨髓瘤样本中由于高浓度单克隆免疫球蛋白的存在做免疫固定电泳时加大稀释倍数,使得与重链相比浓度较低的游离轻链在稀释过程中与抗轻链血清结合的浓度过低,又有相当部分游离轻链排泄于尿中。因此在用血清免疫固定电泳法检测时常常看不到游离轻链的沉淀带,此方法的游离轻链阳性检出率低。

约有40%的IgD型MM患者常出现在抗轻链的泳道上形成两条单克隆成份,经免疫固定电泳证实此两条区带,一条为与IgD结合的轻链,另一条为游离轻链。由于临床上IgD型MM较其它型少,且正常人体内IgD水平极低,即使IgD型MM患者血清中IgD成倍增长但总IgD水平仍偏低,相当一部分患者在做血清免疫固定电泳时与其它完整型MM比较会减少稀释倍数因此在IFE中可见有游离轻链致密条带者可达40%。

轻链型骨髓瘤患者标本在做免疫固定电泳中无与重链抗血清结合的条带,而与某一型抗轻链血清结合形成致密条带。由于小分子轻链生成,通过肾小球滤至尿内出现本周蛋白。血清中轻链浓度往往不高在做血清免疫固定电泳时会减少稀释倍数因此在IF中可见无与重链抗血清结合的条带,而与某一型抗轻链血清结合形成致密条带者可高达90%。

血清游离轻链检测不存在上述做免疫固定电泳所需按重链浓度稀释问题,并且为定量检测,且游离κ和λ不受肾脏功能及尿量影响,有较好的特异性和灵敏性,在骨髓瘤伴随轻链的检测及怀疑病人有单克隆的FLC产生时应首先用血清FLC定量检测来提高疾病的检出率,FLC在体内的半衰期短,用于监测治疗,可及时判断早期复发及微小残留病[5,6],有很高的临床实用价值。

目前血清免疫固定电泳法,在克隆性浆细胞病的免疫分型中,有不可取代的作用,结合血清游离轻链定量检测对多发性骨髓瘤患者的明确诊断、疗效观察及改善预后起重要作用。

[1]梁玉芳,陈文明,王清涛.血清游离轻链检测及其应用[J].中华检验医学杂志,2007,30:1298.

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