超负荷训练致心脏结构改变及心肌细胞过度凋亡的实验研究＊

柳 华,贺磊磊,杨 翼

(1武汉体育学院 健康科学学院,湖北 武汉 430079;2武汉体育学院 研究生部,湖北 武汉 430079)

超负荷训练致心脏结构改变及心肌细胞过度凋亡的实验研究＊

柳 华1,贺磊磊2,杨 翼2

(1武汉体育学院 健康科学学院,湖北 武汉 430079;2武汉体育学院 研究生部,湖北 武汉 430079)

目的:观察超负荷训练对心脏结构及心肌细胞凋亡的影响。方法:根据超负荷概念建立超负荷训练动物模型,训练8周后运用组织学、透射电镜、TUNEL法观察心脏结构变化及心肌细胞凋亡情况。结果:超负荷训练可致心肌纤维肿胀,排列紊乱,部分断裂及局灶状坏死,线粒体大小不一,空泡化,染色质边集等现象;超负荷训练后心肌细胞凋亡数明显多于对照组,与正常大鼠相比差异有显著性(P＜0.05)。且随着训练时间延长心肌细胞凋亡指数不断增高,训练组4、6、8周三个时间点比较均存在显著性差异(p＜0.05)。结论:超负荷训练可使大鼠心肌出现结构性损坏,其原因与超负荷训练致心肌细胞过度凋亡有关;根据超负荷概念建立超负荷训练动物模型达到了超负荷训练的标准,为进一步研究超负荷训练对机体的影响打下了良好的基础。

超负荷训练;;心脏结构;心肌;凋亡

AbstractThe overly trained animal model is established according to the overload concept and the cardiac structure change and the apoptosis of myocardial cells are observed with the histology,the transmission electron microscopy and TUNEL.The over training can cause swelling,disorder,break and focal shape necrosis of the myocardial fibers as well as the different mitochondria sizes,vacuoles and chromatin change.The apoptosis of the myocardial cells after the over training is more than that of the comparative groups and is different with that of the normal mouses(P＜0.05).The longer the over training time,the more the apoptosis of the myocardial cells and the results for the 4th,6th and 8th week are different(P＜0.05).The over training can cause the cardiac structure change and it is related with the over apoptosis of the myocardial cells.The paper proposes to establish the over training animal model on the basis of overload concept.

Key wordsover training;cardiac structure;apoptosis

First author’s addressHealth Science Dept.,Wuhan Sport Univ.,Wuhan 430079,China

在竞争日益激烈的竞技体育运动中,大负荷训练是必不可少的,但运动训练并非刺激强度越大,训练效果越好。它是一门融合了多学科的科学,其安排必须高度符合人体生理机能的变化规律。合理地安排运动训练中的各个环节(负荷强度、持续时间、运动量、恢复方式等),才能产生最大的运动训练效果。超负荷训练是运动训练中最常用的一种训练方法,运动训练过程就是超负荷训练——超量恢复——超负荷训练——超量恢复这种周而复始的过程。研究认为运动训练中心脏肯定存在缺血、缺氧现象,但在其自我保护机制的作用下不会增加心肌细胞的凋亡［1,2］。而一旦运动负荷超出了机体防御的能力与心脏的耐受性,可导致心肌细胞过度凋亡,造成心脏损伤。本研究拟观察超负荷训练后心肌结构的变化以及心肌细胞凋亡的程度,为下一步寻找预防超负荷训练后心肌细胞过度凋亡的方法打下基础。

材料和方法

1.1 实验动物

健康雄性Sprague-Dauley(SD)大鼠 20只,体重 300±30g,三月龄(合格证号 SCXK鄂2008-0004)。分笼饲养,每笼5只,标准啮类动物饲料喂养,自由饮食。动物室温度22℃～28℃,相对湿度50%～65%。

1.2 实验试剂与仪器

TdT酶(Promega Corporation);TUNEL试剂盒、蛋白酶K消化液,辣根过氧化物酶标记链亲合素、DAB显色液、苏木素染色液(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司);中性树胶(中国上海标本模型厂);SKP-02.600电热恒温培养箱(黄石市恒丰医疗器械有限公司),显微镜、摄像装置及成像系统(厦门麦克奥迪实业集团有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 超负荷训练方法

根据超负荷概念建立超负荷训练动物模型,超负荷指的是运动员对某一负荷刺激基本适应后,必须适时、适量地增大负荷使之超过原有负荷,运动能力才能继续增长,这个超过原有负荷的负荷就是超负荷。训练方案同前文［3］。8周后处死动物观测大鼠心脏变化,确定造模成功。正常未训练大鼠作为对照组。

1.3.2 组织学观察

分别切取横向和纵向心脏标本,10%中性福尔马林磷酸盐缓冲液固定24h后,取出,自来水冲洗,梯度酒精脱水,石蜡包埋切片后苏木素-伊红染色(HE染色)。光学显微镜下观察心肌细胞和心肌纤维的变化。

1.3.3 透射电镜观察

大鼠处死后,迅速取左心室前壁心肌组织0.5～1mm3,冲净血液,分别用3%戊二醛和1%锇酸固定,酒精梯度脱水,环氧树脂渗透、包埋,超薄切片,醋酸铀和枸橼酸铅双染色后进行电镜观察。

1.3.4 原位检测心肌细胞凋亡

采用TUNEL法(TdT-mediated dUTP-Dig nick endlabeling)定量观察凋亡细胞。操作步骤:切片常规脱蜡至水,经3%双氧水处理、蛋白酶 K消化后,加入转移酶(TDT)和地高辛标记的核苷酸(Dig-dUTP)4℃过夜,封闭后加生物素化抗地高辛抗体,洗涤,加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液(SABC),DAB显色,光镜下观察。TUNEL阳性细胞的判断标准为细胞核呈棕褐色或棕黄色,并且具备凋亡细胞的形态学特征。随机取10个高倍镜视野,读取凋亡细胞数和总细胞数,计算凋亡指数。凋亡指数=(凋亡细胞数/总细胞数)×100%。

1.3 实验数据分析

所有实验数据均采用均数±标准差(±s)表示,SAS6.12统计软件处理。采用单因素方差分析(SNK法),定义 P＜0.05为显著性界值。

结果

2.1 组织学观察

大鼠心脏HE染色观察可见对照组大鼠心肌纤维排列整齐匀称,毛细血管微动静脉形态正常;训练组大鼠心肌纤维肿胀,排列紊乱,部分断裂及局灶状坏死,内皮细胞肿胀,小血管瘀血(如图1)。

图1 大鼠心脏 HE染色观察(20×)(a:对照组;b:训练组)

2.2 透射电镜观察

结果显示对照组心肌肌原纤维排列规则,肌小节宽度一致,M线、H线清晰;线粒体无明显肿胀,嵴及基质清晰,致密,嵴排列规则整齐;训练组心肌细胞肿胀,肌原纤维排列紊乱,部分断裂,甚至消失,横纹不规则,肌节长短不一;线粒体大小不一,有空泡化表现,嵴模糊不清,闰盘扭曲、扩张,染色质边集;偶见细胞核溶解现象(如图2)。

图2 大鼠心肌透射电镜下观察(1300×)(a:对照组;b:训练组)

2.3 原位检测心肌细胞凋亡

结果显示训练组心肌细胞凋亡数明显多于对照组,两组之间凋亡指数比较存在显著性差异(p＜0.05)。随着训练时间延长心肌细胞凋亡指数不断增高,训练组三个时间点比较均存在显著性差异(p＜0.05)(如图3,表1)。

图3 图3TUNEL法定量观察凋亡细胞(40×)(a:对照组;b:训练4周;c:训练6周;d训练8周)

表1 两组动物心肌细胞凋亡指数比较(%)

讨论

运动训练的本质是人们期望通过一种有意识、有目的、按计划实施的强烈刺激,引起机体相应发生剧烈的应答性变化,产生预期的变化。因此,在强烈的运动刺激作用下,机体几乎每一个系统与器官的机能状态都会受到程度不等的影响。心脏作为对运动强度最敏感的器官,对运动能力的提高起着至关重要的作用。研究结果表明,长期系统的适宜运动可使运动员心脏形态结构与功能产生适应性变化——心室增厚、室内径增大、室间隔增厚每搏量和心肌重量加大,冠状动脉变粗等,导致心肌血供增加、心脏泵血能力提高和身体氧代谢能力增强。

机体对运动刺激的基本反应大体分5个阶段,耐受阶段、疲劳阶段、恢复阶段、超量补偿阶段和消退阶段。在系统的训练和恢复后机体呈现以心肌生理性肥大为特征的适应性心脏结构重塑和心肌细胞超微结构改变,如心房特殊颗粒增多［4］,心肌细胞内高尔基复合体增多、肌质网粒、横管系统发达、核糖体和糖原增多等,这些心肌超微结构的改变是运动心脏形成的基础。而在缺乏充足的外源性超量补偿和良好的疲劳恢复情况下,持续大强度超负荷训练则会造成心肌微损伤,如心肌纤维排列不齐甚至断裂,肌节挛缩,Z线不规则增宽,细胞间质减少,血液淤积,线粒体肿胀,细胞核肿胀、核皱缩、基质变性,染色体边聚,线粒体嵴断裂,大小不等的空泡形成,内质网扩张等心肌损伤的形态学改变［5,6］。本研究中我们观察到超负荷训练大鼠心脏微观结构和超微结构都出现了类似的变化,表明长期、过大的运动强度刺激,可以使机体心肌结构损害累积,最终引起心脏功能下降。

目前,心肌细胞凋亡的研究多数为临床研究,集中在临床疾病发生、发展机制的研究上,但与运动训练引发心肌细胞凋亡有所区别。近年来,国内外对运动训练与心肌细胞调亡之间的关系也进行了一些研究,并形成了一致的观点:运动强度达到一定的阈值后,无论是适宜的运动刺激心竭还是达到力竭程度,运动过程中心脏都会存在一定程度的缺血、缺氧现象［7-9］,这种缺血、缺氧现象必然会引起心肌细胞发生凋亡。然而由于心脏自身防御系统的存在［10］,两种运动强度引起心肌细胞凋亡后的结果却迥然不同:一段时间的适宜运动强度刺激后心肌细胞会发生适应性重塑,当再次受到较强刺激,心肌细胞耐受缺血、缺氧能力会较前明显增强,虽然受损的心肌细胞也会发生凋亡,但它只是受损细胞的自我清除以及心肌结构与功能的自我恢复,呈现为生理性反应过程;而一段时间的反复大强度运动可导致心肌细胞凋亡比率明显增加,当凋亡的细胞无法有效清除后,细胞受损累积,心脏会由生理性改变向病理性改变发展,最终引起心脏损害,这也可能是过度训练导致心肌细胞损伤的病理机制之一。金其贯、常芸、张钧等［7-9,11］学者的研究都表明,力竭运动和超负荷运动时,大鼠心肌细胞凋亡显著增加,且随着强度的加大,凋亡细胞的数目上升,说明心肌细胞凋亡可能参与了心脏实质细胞的丢失,与运动损伤有关,并且心肌细胞凋亡可能是心脏由生理性向病理性转变的诱因之一。

与众多学者研究结果一致,我们也观察到超负荷训练会引起心肌细胞凋亡指数明显增高,表明我们所制作的动物模型达到超负荷训练标准,为进一步研究超负荷训练对机体的影响打下良好的基础,并最终为运用中医药手段减轻超负荷训练对机体的影响提供了可靠的训练方式。

［1］常芸,袁箭峰,祁永梅,等.运动心脏重塑与微损伤发生中的细胞凋亡现象［J］.中国运动医学杂志,2003,22(4):344-349.

［2］张钧,许豪文,杨小英,等.运动对心肌线粒体钙和细胞色素C的影响［J］.体育科学,2003,23(2):130-133.

［3］杨翼,马杰,靳丹,等.内关、足三里电刺激预处理对心肌内源性保护物质的影响［J］.武汉体育学院学报,2009,43(7):37-40.

［4］丁孝民,王传伟.运动训练中心肌细胞凋亡的研究进展［J］.山东体育科技,2005,27(3):31-33.

［5］郭勇力,刘霞,张文峰,等.不同强度运动对大鼠心肌细胞凋亡的影响［J］.中国临床康复,2004,8(9):1732-1733.

［6］Paulus WJ.Cytokines and heart failure［J］.Heart Fail Monit,2000,1(2):50-56.

［7］Carraro U,Franceschi C.Apoptosis of skeletal and cardiac muscles and physical exercise［J］.Aging(Milano),1997,9(1-2):19-34.

［8］袁海平,刘学,史仍飞,等.补充银杏制剂对过度训练大鼠心肌细胞凋亡的影响［J］.中国运动医学杂志,2004,23(5):503-506.

［9］张钧,许豪文,杨小英,等.运动对心肌细胞凋亡的影响［J］.体育科学,2002,22(5):92-94.

［10］Dipak k,et al,Gene expression in acute myocardial stresss,induction by hypoxia,ischemia,reperfusion,hyperthermia angstress［J］.J Mol Cell Cardiol,1995,(7):181-193.

［11］金其贯,邓荣华,李宁川,等.过度训练对大鼠心肌细胞凋亡的影响［J］.中国运动医学杂志,2000,19(4):356-359.

(2010-9-16收稿)

Experimental study of cardiac structure change caused by the over training and over apoptosis of myocardial cells

LIU Hua,HE Lei-lei,YANG Yi

G804.22

A

1672-268X(2010)02-046-03

国家自然科学基金项目(30700388);湖北省教育厅科研计划项目(Q20083303)。