发光二极管荧光显微镜检测结核分枝杆菌的临床应用评价

邵燕 朱永东 陶友爱 彭红 李国莉 陈诚 许卫国

根据世界卫生组织2009年全球结核病报告显示，中国是全球第二位的结核病高负担国家。目前，我国结核患者的发现主要依靠基层医疗机构的痰涂片镜检技术。由于萋－尼（Ziehl－Neelsen，Z－N）染色和普通光学显微镜镜检具有操作简单、特异度较高、价格低廉等优点，虽然已有百余年的历史，但仍是目前我国基层实验室诊断结核病的主要方法。但大量的研究也表明Z－N染色的痰涂片检测肺结核的敏感度波动范围较大，达20%～80%［1－3]，而金铵 O 或罗丹明荧光染色的痰涂片经传统荧光显微镜（fluorescence microscopy，FM）检测，其敏感度平均可提高10%［4－5]。但传统荧光显微镜的检测成本过高，不适用于发展中国家。发光二极管荧光显微镜（light－emitting diodes，LED）很好地解决了该问题，同时相对于普通光学显微镜具有观察时间短、应用良好等优点。

因此，中国卫生部－盖茨基金会结核病防治合作项目（简称“中盖结核病项目”）结核病新诊断工具可行性子项目将LED技术引入我国结核病基层实验室进行临床应用研究，江苏省淮安市淮阴区参加了该项目的实施。为探讨LED在基层临床应用效果，笔者对淮阴区验证阶段的有关数据进行了统计和分析。

资料和方法

一、实验器材

项目实施中，传统光学显微镜（conventional microscopy，CM）为奥林巴斯 CX21FS1－2；FM 为蔡司Imager A1，所用物镜为20×；LED为蔡司Primo Star iLED，所用物镜为20×。

二、研究对象

项目验证阶段（2009年12月21日至2010年5月7日）淮阴区所有痰涂片，包括Z－N染色涂片和荧光染色涂片，分别为1941张和1940张。

三、验证设计

本项目共包括预试验、验证阶段及示范阶段3个部分。项目点检验人员在培训后经3周预试验熟悉荧光染色操作流程和LED的使用方法。此阶段结束前由省级对项目点进行质量评估和批量测试，合格后进入下一阶段。验证阶段为12周，凡是该阶段初诊和随访结核患者均为纳入对象，每份痰标本涂2张玻片，分别进行Z－N染色和荧光染色。项目点的2名实验室人员分别用普通光学显微镜和LED显微镜进行读片并报告结果，每2周轮换1次。此外，每2周由省疾病预防控制中心结核病实验室（以下简称省级结核病实验室）对项目点的所有涂片进行复核，其中复核荧光染色涂片时省级结核病实验室使用的是传统荧光显微镜。所有涂片的最终结果以省级结核病实验室复核为准。

四、实验方法

（1）涂片染色及镜检：①Z－N染色：涂片自然干燥后，0.8%石碳酸复红加热染色，直至出现蒸汽，保持染色5min；流水轻缓冲洗，5%盐酸乙醇脱色1min，流水冲洗；亚甲蓝复染30s。②荧光染色：0.1%金铵O染色30min；流水轻缓冲洗，5%盐酸乙醇脱色3min；最后滴加0.5%高锰酸钾染色1min。（2）读片：Z－N染色涂片经10×目镜及40×物镜调节焦距，100×油镜读片；荧光染色涂片经20×物镜读片。

以上详细的操作步骤和判读标准均按照《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》［6]进行。

五、资料的统计学处理

运用增强配对卡方检验（McNemar－Bowker test）对多分类计数配对资料进行统计学处理，2组实验的一致性比较使用Kappa检验（Kappa值在0.75以上为较强，0.4～0.75为一般，0.4以下为较弱。利用SPSS 11.5软件进行统计分析，P＜0.05认为有统计学意义。

结 果

验证阶段淮阴区完成3882张涂片，包括Z－N染色和荧光染色，经省级复核3881张涂片（其中1张荧光涂片由于运输后破损，未能复检）。复检后，Z－N染色涂片阳性片284张，阳性率（Z－N染色阳性涂片数／Z－N染色总涂片数）为14.6%，低假阳性4张，低假阴性9张，符合率99.3%；荧光染色涂片中阳性片464张，阳性率23.9%（荧光染色阳性涂片数／荧光染色涂片总数），低假阳性39张，低假阴性6张，符合率97.6%（表1）。

在所有的痰涂片中，至少1种方法判读为阳性的共511张，其中LED阳性为498张，其中有1张LED阳性片因破损未能经FM复核，FM阳性464张，而Z－N染色仅284张阳性。LED和FM不一致的共46张，6张FM阳性而LED阴性，39张FM阴性、LED阳性，1张FM 1＋而LED 3＋；LED和Z－N染色不一致的共268张，其中Z－N染色阴性、LED阳性的有220张（表2，3）。经 McNemar－Bowker test检验，差异均有统计学意义。LED和FM比较Kappa 值 为 0.903，LED 和 ZN 的 Kappa 值为0.409。

表1 淮阴区验证阶段不同检测方法痰涂片检测结果（张）

为了比较Z－N染色和LED在发现结核患者及患者随访过程中的差异，运用回顾性研究统计了该阶段部分患者的临床诊断结果，分析其与Z－N染色及LED之间的关系。结果显示，对78例新发涂阳患者，2种方法的检查结果一致，均为阳性；而在113例涂阴患者中，Z－N染色均为阴性，LED则检出了14例阳性；另外，378例涂阳随访患者中有33例Z－N染色为阴性，而LED检出为阳性（表4）。

讨 论

目前我国基层结核病实验室发现患者主要依靠Z－N染色CM镜检，但现有的研究表明，Z－N染色敏感度不高，阳性检出率低；FM敏感度高于Z－N染色，但成本过高，不适用于我国基层实验室；而新近的LED技术相对于Z－N染色和FM敏感度均有明显提高。本研究也表明，荧光染色LED读片阳性率比Z－N 染色提高近10%。经 McNemar－Bowker test检验，LED与Z－N染色及FM的比较差异均具有统计学意义（P＜0.001）。而 Kappa检验提示LED和FM 的一致性较高（Kappa＝0.903），LED和Z－N染色则一致性一般（Kappa＝0.409）。结合上述McNemar－Bowker test检验结果，说明LED在阳性率方面优于Z－N染色。

表2 FM与LED检测结果比较（张）

表3 Z－N染色与LED检测结果比较（张）

表4 临床诊断结果与Z－N染色及LED比较（例）

此外，在本研究中淮阴区2名工作人员分别独立完成了1941张Z－N染色片和1940张荧光染色片的镜检工作，经省级定期复检后发现，Z－N染色和LED的符合率均达到了95%以上，但LED检测的低假阳性误判率高于Z－N染色。对于以上结果，笔者考虑可能相对于基层长期使用的Z－N染色镜检，检验人员对于荧光染色技术和LED显微镜的把握度比较低，区分杂质和菌体的能力还有待进一步提高。

进一步分别比较LED与Z－N染色和FM的差异，发现主要集中在定性区别上。其中，LED和FM符合度较高，均在1＋以内，这和 Mizuno等［7]的研究结果类似。而LED和Z－N染色的结果差别明显，甚至存在1＋以上的差别。

此外，笔者比较了部分纳入患者临床诊断结果与Z－N染色及LED的关系，发现LED和Z－N染色在新发涂阳患者的检测中无差别，但是对涂阴患者的检测结果有较明显不同，LED比Z－N染色多检出了14例阳性。与此同时LED的随访阳性率也明显高于Z－N染色。国内外很多研究都表明LED在敏感度和特异度方面明显优于Z－N染色，特别是LED和金标准改良罗氏（L－J）培养符合率很高，假阳性率明显低于Z－N染色［8－9]。这提示在患者发现及疗效随访过程中，LED可以更有效地提高患者发现率及指导临床治疗。

通过此次研究，笔者还发现LED在基层实验室应用过程中还有很多细节需要完善。特别是对于大部分检验人员而言，荧光染色LED镜检技术还是比较陌生的，经短期培训后仍然存在读片效果反而低于Z－N染色的问题。最近一项在印度的研究也表明，虽然在很多方面LED检测相对于Z－N染色和FM有明显优势，但必须有足够的培训和标准化操作才能确保其最大限度的准确性［10]。因此，作为结核病诊断的新技术，LED具有很大的推广价值，有利于我国的结核病发现和控制。但为了达到这一目标，需要对检验人员进行系统、充分的操作培训，建立完善的标准化操作规程和质量保证体系，以帮助检验人员迅速适应并掌握该技术。

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