水蛭水煎醇沉工艺的正交设计研究

于栋华，张颖，徐红英，于纯淼

(1.黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

水蛭(Hirudo)为水蛭科动物蚂蟥的干燥全体，是传统中药材，具有破血、逐瘀、通经之功效［1］。水蛭药性峻猛，是常用的破血药。国内以宽体金线蛭为主流商品［2］，临床上多用此类水蛭。现代研究表明，水蛭在抗凝血、抗血栓形成等方面表现出强烈的生物活性，可用于心脑血管疾病的治疗［3］。水蛭中有效成分水蛭素(Hirudin)是一种非常稳定的抗凝血蛋白质。研究表明［4］，水蛭素性质稳定，单纯温度升高(100℃水浴)和pH值的改变(1～13)不影响其活力。只有当温度和pH值同时升高时其活力才开始下降，在pH=13的条件下经80℃处理15min即完全失活。水蛭素与凝血酶的亲和力极强，1μg水蛭素可中和5μg凝血酶，相应摩尔比为1∶1，即中和一个国际单位(NIH单位)的凝血酶需要一个抗凝单位(lAT－μ)的水蛭素［5］。

作者通过预实验得出单纯的水煎或单纯醇提效果都不如水提醇沉的抗凝效果好。故采用水提醇沉的方法对水蛭进行提取。以双缩脲比色法结合凝血酶滴定法计算其比活力为指标，考察煎煮时间、乙醇浓度、醇沉时间和加水量对水蛭提取物的影响，选择最佳工艺路线，并确定水蛭提取制备工艺。

1 实验材料和仪器

宽体金线蛭(山东水产养殖中心);纤维蛋白原(美国Sigma公司);凝血酶(美国Sigma公司);牛血清白蛋白(美国Sigma公司);双缩脲试剂(上海荣盛生物技术有限公司);Tris碱;95%乙醇;旋转蒸发仪;离心机;水浴锅。

2 实验方法

2.1 水蛭素含量的测定—凝血酶滴定法［6］

取纤维蛋白原0.25g，溶于50mL的Tirs－HCl缓冲液(pH值≈7.4)中，得0.5%的纤维蛋白原溶液。稀释凝血酶到5NIH/mL。取200μL纤维蛋白原溶液，加入100μL水蛭提取液，并滴加凝血酶，当出现胶冻状凝块时即为滴定终点，从滴定的凝血酶用量即可推算出待测样品中的水蛭素的活力单位数。

2.2 水蛭素蛋白含量测定—双缩脲法

取一系列试管分别加入 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL标准牛血清白蛋白溶液(6mg/mL)，用水补足至2mL，在37℃下分别加入4mL双缩脲试剂，用分光光度计在540nm处测定其吸光度，吸光度(A)分别为0.000、0.099、0.200、0.304、0.399、0.500。以 A 为纵坐标，牛血清白蛋白含量(C)为横坐标绘出标准曲线(见图1)。其线性方程为 A=0.041 7c+0.000 05(R=0.999 9)。取图1双缩脲比色法测蛋白含量标准曲线2.0mL待测样品按上述方法测及吸光度。计算蛋白质含量。

图1 标准曲线

用测得的蛋白质含量结合用凝血滴定法测得的数据，可求出待测样品中水蛭素的比活力:比活力(ATU/mg)=水蛭素的活力单位数/蛋白含量。

3 正交实验优选提取工艺

3.1 因素水平表 见表1。

表1 因素水平表

3.2 正交实验方法及数据

将水蛭药材粉碎成粗粉，称取10g，共9份，按表2中L9(34)设计方法分别提取。提取液过滤，浓缩至50mL，按表2进行醇沉后，醇沉液离心取上清液，回收乙醇浓缩至50mL。

表2 正交实验设计表及结果

直观分析表明，以水蛭素比活力为标准，在所选因素水平范围内，四因素影响大小顺序为D(醇沉时间)＞A(煎煮时间)＞C(醇沉浓度)＞B(加水量)，最佳提取条件为A2B1C3D2，即水蛭粗粉加(20+10)倍水煎煮(60+30)min后，提取液80%乙醇醇沉24h。

3.3 验证实验

分别称取3份水蛭粗粉，按优选工艺A2B1C3D2，重复提取3次，得平均比活力为38.357 ATU/mg，RSD=2.33%，表明试验所确定的最佳工艺为较优工艺。

4 结论

水蛭素的检测方法还未有统一的标准，目前以单一方法检测水蛭素优选水蛭提取工艺实验较多。本实验过程利用了水蛭素和凝血酶Ⅱ的配比关系测定不同条件水蛭提取液的水蛭活力单位数，并结合蛋白质含量的测定，以水蛭素比活力为标准，确定了水蛭提取的最佳条件。此方法有较好的准确性。实验结果表明，(20+10)倍水煎煮(60+30)min后，提取液80%乙醇醇沉24h条件最佳。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典［S］.北京:化学工业出版社，2005:57.

［2］ 吕文海，公素琴，杜征国，等.水蛭饮片规格质量的调查及实验研究［J］.中国中药杂志，1995，20(11):665 －668.

［3］ 董晓云，饶高雄，林亚明，等.以抗凝血活性指标筛选水蛭的提取工艺［J］.云南中医学院学报，2002，25(3):23 －25.

［4］ 周进科，刘翠萍.凝血酶抑制剂－水蛭素［J］.中国新药杂志，1997，6(3):186.

［5］ 于秉新，李爱君，邵民象.水蛭开发与临床应用［J］.时珍国医国药，2000，11(2):179 －180.

［6］ 陈华友，邢自力，李媛媛，等.凝血酶滴定法测定水蛭素活性的改进［J］.生物技术，2002，12(6):24 －25.