siRNA沉默CD147基因对肝癌细胞的影响

赵先胜，任志群

(1.浙江省宁波市传染病医院，浙江 宁波 315010; 2.西安交通大学医学院第一附属医院肝病科，陕西 西安 710061)

肿瘤的侵袭生长是一个多因素、多步骤的过程，细胞外基质(主要是Ⅳ型胶原蛋白)不仅是肿瘤细胞赖以生存的场所，还是肿瘤细胞迁徙的天然屏障。CD147又被称为促细胞外基质金属蛋白酶因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN)或basigin，在肿瘤细胞表面高度表达，刺激肿瘤细胞周围的成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶(MMP)。研究发现，CD147在多种肿瘤中高表达，同时MMP活性增加，与肿瘤的浸润和转移密切相关。笔者通过下调CD147基因表达来观察肝癌细胞增殖及凋亡的改变，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

含有人 U6启动子的 pSilencerTM4.1－CMV neo质粒(美国Ambion公司);大肠杆菌DH5α(大连宝生物工程有限公司);限制性内切酶(Bam HⅠ，HindⅢ)、T4 DNA连接酶(美国 NEB公司);DNA marker(大连宝生物工程有限公司);质粒小量抽提试剂盒(天为时代公司);胶回收试剂盒(广州美津生物公司);Lipofectamine 2000转染试剂盒、G418(美国 Invitrogen公司);内参 β－actin、CD147单克隆抗体(美国R＆D公司)。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的制备

根据美国基因序列数据库中报道的CD147基因核苷酸序列(NM_198589)，输入Ambion公司的在线siRNA设计软件，软件将自动分析和显示候选siRNA。根据文献[3－4]报道的siRNA设计原则和经验，进一步在候选siRNA中筛选最佳者。设计的siRNA由上海吉凯基因化学技术有限公司合成，引物序列见正义链:5'－AGCTTAAGACCTTGGCTCCAAGATACTCTCTTGAAGTATCTTGGAGCCAAGGTCG－3';反义链:5'－GATCCGACCTTGGCTCCAAGATACTCAAGAGAGTATCTTGGAGCCAAGGTCTTA － 3'。

1.2.2 CD147/siRNA表达载体的构建及鉴定

参照Ambion公司说明书，将合成的siRNA连接至pSilencerTM4.1－CMV neo质粒，转化至DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆，用质粒小量抽提试剂盒小量提取质粒后，载体CD147/siRNA经BamHⅠ和HindⅢ双酶切，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，样本送检行DNA测序。

1.2.3 细胞转染与筛选

细胞培养条件为10%胎牛血清、100 g/L青霉素和100 g/L链霉素的RPMI 1640培养基于37℃和5%CO2条件下培养。转染前24 h用2.5 g/L胰蛋白酶消化人HepG2细胞，具体操作按Invitrogen公司转染试剂盒Lipofectamin2000操作说明书进行。

1.2.4 蛋白印记试验检测CD147基因表达

用蛋白裂解液RIPA裂解HepG2细胞，测定蛋白浓度，行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将蛋白转印至硝酸纤维素膜，10%BSA血清封闭液中封闭1 h，然后鼠抗人－CD147单克隆抗体(1∶500)4℃孵育过夜，TBST液清洗3次，每次10 min，而后再与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体(1∶5 000)室温孵育2 h，在暗室中，采用化学发光反应试剂盒进行发光，暗室曝光。

1.2.5 MTT 法测定细胞活性

取对数生长的稳定转染细胞的各组细胞，每孔按浓度为5×103个/mL接种于96孔培养板上，接种后48 h，用MTT法分别测定每孔光密度，各组细胞均设6个复孔，取平均值计算细胞活性。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

转染后的肝癌细胞加入培养缓冲液，按Immuno－tech公司的说明书进行，1×106个/mL细胞用冰PBS液洗2次，调整细胞浓度为 1×106个 /mL，加 5 μL Annexin V 液(1∶10稀释)和 5 μL 碘化丙锭(250 μg/mL 于 490 μL 细胞悬液中，冰浴放置 10 min，用流式细胞仪分析细胞凋亡情况。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 重组载体的鉴定

结果见图1。采用HindⅢ和BamHⅠ双酶切重组载体，12%聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，可见55 bp处有明显条带(图1 A)，相应部位测序后证实碱基序列和设计序列一致(图1 B)，表明载体构建正确。

图1 限制性内切酶鉴定CD147/siRNA重组表达载体及重组质粒测序

2.2 siRNA对CD147蛋白表达的影响

结果见图2。稳定转染后，siRNA组表达量明显下降，但未处理的HepG2组及转化的空质粒组表达量无明显变化。

图2 各位细胞中CD147蛋白表达情况

2.3 MTT法检测各组细胞活性

结果见图3。siRNA组细胞生长受到明显影响 (P＜0.05)，空白对照组及空质粒之间细胞增殖情况无显著性差异(P ＞0.05)。

图3 MTT法检测48 h后各组细胞活性

2.4 细胞凋亡检测结果

转染siRNA组的细胞的凋亡率显著增加(14.85 ±1.35)%，与未转组(4.51±0.36)%、转染空 siRNA 载体组(6.13% ±0.71)%比较，差异有显著性(P＜0.05)，说明沉默CD147基因表达可增加细胞的凋亡。

3 讨论

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)所引起的序列特异性基因沉默，siRNA是21－23 nt小片段双链RNA，可以特异性和互补靶基因mRNA序列结合，诱导其降解，产生强大的RNA干扰效应[1－2]。siRNA与靶序列之间严格的碱基配对，具有很强的特异性，它可以在染色质水平、转录水平、转录后水平和翻译水平中参与基因表达的调节。尽管RNAi的效果看似和靶序列与siRNA的结合性有关，但目前并没有可靠的方法来预判或鉴别RNAi的理想靶序列[3]。有报道指出，化学合成和载体介导的siRNA在哺乳动物细胞，包括恶性肿瘤细胞中都能成功地沉默特定的基因[4]。

Biswas等[5]将CD147分子纯化后，发现CD147能体外诱导成纤维细胞合成 MMP－1，MMP－2，MMP－3。随后对 CD147研究发现，在骨巨细胞瘤、泌尿系肿瘤、肺癌、乳腺癌、结直肠癌、口腔鳞状细胞癌、神经胶质瘤、成釉细胞癌、子宫内膜癌、骨髓癌、皮肤基底细胞癌、黑色素瘤、皮肤鳞状细胞癌等肿瘤细胞中均发现CD147表达升高，同时MMP活性增加，且与肿瘤的浸润和转移相关[6]。在后续的一些研究中，人们发现CD147分子亦可作为评价多种恶性肿瘤预后的一个指标[6]，其高表达往往提示肿瘤的预后不良。

肝癌因其恶性程度高、预后差，一直受到人们的关注，其药物治疗已经有了很大的进展[7]。中医药也已有一定作用，但总体效果欠佳[8]。笔者根据美国基因序列数据库中报道的CD147基因核苷酸序列，参考siRNA设计原则设计出了两条针对CD147基因表达的RNAi序列，并成功克隆至载体CD147/siRNA，试验证明它能下调肝癌细胞CD147蛋白的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肝癌细胞的凋亡。提示抑制CD147基因表达，是肝癌治疗的一个靶点，为肝癌的基因治疗提供了可能。

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