特发性血小板减少性紫癜患者外周血B1细胞变化与病情及预后的关系

罗洪强，林茂芳，谢万灼，傅佳萍，封蔚莹，汤秋霞

特发性血小板减少性紫癜 (ITP)是一种自身免疫性疾病，目前认为其发病与机体的免疫功能紊乱有关，近年来国内外研究提示B淋巴细胞亚群失衡以及细胞凋亡的失常与自身免疫相关性疾病的关系密切［1－2］。本研究观察了 ITP患者外周血液中B1细胞以及药物治疗后对它们的影响，以便进一步阐明该病的发病机制并对预后做出评估，更有效地运用免疫调节手段进行分层治疗。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2007年1月—2010年10月在我院住院治疗的94例ITP患者，诊断符合张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》第3版［3］，排除其他免疫性疾病。其中男29例，女65例;平均年龄47.5岁 (17～64岁)。94例ITP患者中57例为初治 ITP患者 (初治 ITP组)，其中39例对甲泼尼龙治疗有效，18例对甲泼尼龙治疗无效;37例为难治性ITP患者 (难治性ITP组)。病程6个月～5年，患者均接受过正规肾上腺糖皮质激素治疗6周以上［4］，治疗后患者的血小板 (PLT)计数 ＜30×109/L，其中7例曾应用长春新碱或环磷酰胺治疗，6例曾用丙种球蛋白治疗，5例行脾切除术。治疗前皮肤均有不同程度的出血点或瘀斑，月经过多8例，牙龈渗血6例，鼻出血4例，PLT(9～24) ×109/L。选择同期在我院进行健康体检正常者20例为对照组，男8例，女12例;平均年龄44.2岁 (21～65岁)。

1.2 观察指标 外周血CD+19细胞、B1细胞、血小板相关免疫球蛋白 (PAIgG)、PLT计数。

1.3 检测方法 (1)试剂单克隆抗体CD5－FITC、CD19－PE及阴性对照试剂鼠抗人IgG1－PE均购自法国Immunotech公司。流式细胞仪型号EPICS－XL，为美国Beckman－Coulter公司产品。检测过程:采用直接免疫荧光法检测，抽取外周血1.5 ml(抽血后3 h内完成检测)，将EDTA抗凝全血100 μl和 CD5－FITC、CD19－PE单克隆抗体20 μl置于测定管，而在对照管中加入CD19－PE和鼠抗人IgG1各20 μl作为阴性对照，室温避光孵育15 min，溶血后上机测定，数据收集后计算出CD+19细胞 (总B淋巴细胞)及B1细胞(CD5+CD+19细胞)百分率。 (2)PAIgG检测:用流式细胞仪检测PAIgG，其中血小板相关抗体 (鼠抗人IgG)一抗，羊抗鼠IgG(H+L)二抗FITC2F(ab)2以及阴性对照试剂IgG1(mouse) －PE均购自法国Immunotech公司。(3)幽门螺杆菌 (H.pylori)的检测通过14C尿素呼吸试验 (UBT)及H.pylori抗体双阳性确定。

1.4 治疗方法 初治ITP组57例，甲泼尼龙针剂量为1～2 mg/kg静脉滴注，1次/d，待PLT计数恢复正常后逐渐减量，并改泼尼松片口服维持3～6个月;37例难治ITP组患者抗H.pylori治疗前停用所有的免疫抑制剂，治疗2周后复查H.pylori和PLT计数。抗H.pylori治疗方法:奥美拉唑20 mg 2次/d+克拉霉素500 mg 2次/d+阿莫西林1 000 mg 2次/d，疗程2周。

1.5 PLT疗效标准 参照张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》第三版［3］，(1)显效:PLT计数恢复正常，无出血症状，持续＞3个月。维持＞2年无复发者亦称基本治愈。 (2)良效:PLT计数升至50×109/L或较原水平上升＞30×109/L，无或基本无出血症状，持续＞2个月。 (3)进步:PLT计数有所上升，出血症状改善，持续＞2周。(4)无效:PLT计数及出血症状无改善或恶化。

1.6 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件进行统计分析，计量资料采用 (ITP组治疗前CD+19细胞、B1细胞、PAIgG±s)表示，组间比较采用方差分析或两独立样本的t检验，组内比较采用配对样本t检验。两变量间关系采用直线相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组观察指标比较 3组受检者治疗前外周血CD+19细胞、B1细胞、PAIgG及PLT水平比较，差异均有统计学意义 (P＜0.05)。其中对照组与初治ITP组、难治ITP组治疗前CD+19细胞、B1细胞、PAIgG、PLT水平比较，差异均有统计学意义 (P＜0.05)，而初治ITP组与难治及PLT水平比较，差异均无统计学意义(P＞0.05，见表1)。

2.2 初治ITP患者甲泼尼龙治疗前后观察指标比较 患者甲泼尼龙治疗有效组与无效组患者治疗前CD+19细胞、B1细胞、PAIgG水平比较，差异均无统计学意义(P＞0.05);治疗后两组上述指标的水平比较，差异均有统计学意义 (P＜0.01)。治疗有效组治疗前后CD+19细胞、B1细胞、PAIgG、PLT水平比较，差异均有统计学意义 (P＜0.01);而无效组患者治疗前后的CD+19细胞、B1细胞、PAIgG、PLT水平比较，差异均无统计学意义 (P＞0.05，见表2)。

2.3 难治性ITP患者抗H.pylori治疗前后观察指标比较 抗H.pylori治疗前后患者的CD+19细胞、B1细胞、PAIgG、PLT水平比较，差异均有统计学意义 (P＜0.05，见表3)。

2.4 ITP患者外周血B1细胞、PAIgG、PLT计数相关性 57例初治ITP患者外周血B1细胞与PLT计数呈负相关 (r=－0.790，P＜0.05);其中B1细胞＜4%共17例，PLT计数为 (32±5) ×109/L;B1细胞4% ～8% 共26例，PLT计数为(24±5) ×109/L;B1细胞＞8% 共14例 PLT计数为 (10±3) ×109/L。B1细胞与 PAIgG呈正相关 (r=0.821，P＜0.05)。外周血PLT计数与PAIgG呈负相关 (r=－0.754，P＜0.05)。

表1 3组受检者治疗前观察指标的水平比较 ±s)Table 1 Comparison of the observed indices among the three groups

表1 3组受检者治疗前观察指标的水平比较 ±s)Table 1 Comparison of the observed indices among the three groups

注;与初治ITP组比较，*P＞0.05;与其他两组比较，△P＜0.05。PAIgG=血小板相关免疫球蛋白，PLT=血小板

组别 例数 CD+19细胞(%) B1细胞(%) PAIgG(%) PLT(×109/L)对照组 20 11.1± 7.4△ 2.1±1.2△ 12± 8△ 158±46△初治ITP组 57 21.0±10.0 9.2±5.2 28±19 26± 8难治ITP组 37 21.4± 7.2* 9.2±4.9* 33±14* 18± 9*F＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 4.56 5.37 3.98 6.24 P值值

表2 初治ITP患者甲泼尼龙治疗效果与观察指标水平的关系 (±s)Table 2 Correlations between curative effects of methylprednisolone and the observed indices in untreated patients

表2 初治ITP患者甲泼尼龙治疗效果与观察指标水平的关系 (±s)Table 2 Correlations between curative effects of methylprednisolone and the observed indices in untreated patients

注:与治疗前比较，*P＜0.05;与治疗前比较，△P＞0.05

组别 例数 CD+19细胞 (%)治疗前治疗后有效组 39 20.8± 9.1 11.1± 4.6* 8.9±15.2 2.5±1.8* 27± 4 13±8* 26±4 216±65治疗后B1细胞 (%)治疗前 治疗后PAIgG(%)治疗前 治疗后PLT(×109/L)治疗前*无效组 18 20.3±10.0 18.7±10.4△ 8.8± 5.3 7.9±5.6△ 31±26 25±3△ 20±5 23± 5△t 0.18 2.97 0.07 4.00 0.65 8.2 4.48 18.43 P值 ＞0.05 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01值

表3 难治性ITP患者抗H.pylori治疗前后观察指标比较 (±s，n=37)Table 3 Comparison of the observed indices before and after eradication of H.pylori in refractory patients

表3 难治性ITP患者抗H.pylori治疗前后观察指标比较 (±s，n=37)Table 3 Comparison of the observed indices before and after eradication of H.pylori in refractory patients

抗HP治疗 CD+19细胞(%) B1细胞(%) PAIgG(%) PLT(×109/L)21.4±7.2 9.2±4.9 33±14 18± 9治疗后 15.3±4.4 4.9±3.6 19± 3 48±12 t治疗前2.75 2.15 2.54 3.12 P值值＜0.01 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.01

3 讨论

ITP是一种血小板免疫性破坏、外周血中PLT计数减少的出血性疾病，其发病机制尚不清楚，近几年来许多国外学者Arita等［5］研究表明 ITP患者 B1细胞(CD5+B淋巴细胞)水平表达异常，在ITP发病中所起的作用越来越受到重视，其主要表现为B1细胞水平及PAIgG明显升高，B1细胞水平及PLT计数水平呈明显负相关，病情缓解后B1细胞水平下降［6－7］。

本研究结果显示57例初治ITP患者外周血B1细胞与PLT计数呈中度负相关，B1细胞与PAIgG呈中度正相关，外周血PLT计数与PAIgG呈中度负相关。在甲泼尼龙治疗有效组，治疗后患者外周血B1细胞及PAIgG水平明显下降，而无效组B1细胞及PAIgG水平未见下降，说明甲泼尼龙治疗后，疗效较好的患者其外周血B1细胞水平逐渐下降并恢复正常，使免疫状态达到新的平衡;而治疗无效的患者其B1细胞水平未见下降，说明治疗后仍处在免疫功能紊乱状态，提示患者B1细胞水平与病情及预后存在一定的相关性，可作为评估预后及疗效的一项参考指标，也可能是判定ITP治疗后免疫功能是否恢复正常的一种参考指标;若结合PAIgG水平及其他的临床相关资料，有可能为不同患者进行分层治疗提供依据。当然B1细胞水平与ITP的发生和疗效的关系，还有待进一步随机双盲的大样本研究验证。

目前国内外研究还显示ITP发病与各种病原体感染如病毒、细菌有关［8－9］，感染后引起人体内免疫功能紊乱，从而导致PLT计数下降。其中H.pylori感染目前被认为是引起ITP的确切的病因之一［4］，其可能机制是H.pylori与血小板某些抗原成分存在交叉性，感染后易被机体免疫系统识别，产生 PAIgG［10］，或慢性炎症使机体细胞因子网络发生变化，产生免疫失耐并激活B淋巴细胞，但H.pylori感染后是否通过激活B1淋巴细胞引起免疫功能紊乱，目前尚不明确。

本研究通过对37例H.pylori感染的难治性血小板减少性紫癜 (RITP)患者治疗前后外周血B1淋巴细胞、PLT计数进行监测分析发现，RITP患者外周血B1细胞的数量明显高于正常者，分别为(9.2±4.9)% 和 (2.1±1.2)%，这与国外的研究结果一致［11－12］，提示B1细胞在ITP发病过程中有重要的作用。有效抗H.pylori治疗后37例RITP外周血B1细胞水平总体上较治疗前有所下降， (4.9±3.6)% 和 (9.2±4.9)%，PLT计数较治疗前有所上升，(48±12) ×109/L和(18±9) ×109/L，有效抗 H.pylori治疗后，PLT计数有所上升，而B1细胞水平有所下降，说明抗H.pylori有效治疗与B1细胞的变化存在一定的相关性，换角度说，以上结论间接提示H.pylori感染引起ITP的发病可能通过B1细胞途径而发挥作用，当然这还有待于进一步的临床与基础研究来证实。

本研究对初治ITP患者用激素治疗以及难治性ITP患者抗H.pylori感染治疗前后B1细胞水平变化进行分析，使我们更清楚地看到B1细胞在ITP发病中的重要作用，提示ITP患者外周血B1细胞水平与病情及预后存在一定的相关性。

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