依达拉奉对创伤性脑水肿大鼠AQP4表达的影响

丁忠阳

(无锡市人民医院，江苏 无锡 214023)

脑水肿是由于各种致病因素导致的过多水分积聚在脑细胞内或细胞外间隙，引起脑容积增大。创伤性脑损伤是造成脑水肿最常见原因，可进一步引起颅内压升高，危及患者生命，是神经外科需要解决的一大难题［1，2］。近年研究表明，脑组织中水通道蛋白4(AQP4)参与了神经系统疾病导致的脑水肿形成，而且在病理过程中产生的大量氧自由基对脑水肿形成也起至关重要作用［3］。依达拉奉作为抗氧自由基类药物是治疗脑水肿的常用药物。2010年1～6月，本研究通过观察创伤性脑水肿大鼠不同时间脑组织AQP4的水平，探讨依达拉奉对脑水肿大鼠AQP4表达是否具有调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料 Wistar大鼠75只(雄性，体质量200～250 g，购自南京医科大学实验动物中心);Trizol试剂盒购自Invitrogen公司;依达拉奉注射液购自南京先声东元制药。

1.2 模型建立及分组 75只大鼠随机分成对照组、模型组和治疗组，每组25只。每组分为5个亚组，每个亚组5只。模型组及治疗组均根据Feeney等方法，首先使用水合氯醛(300 mg/kg)麻醉大鼠并预留心导管。然后将大鼠固定在立体定位架上，将头部去毛暴露出头皮，常规局部消毒后，无菌条件下切开头皮，暴露左顶骨。用牙钻于矢状缝左旁开2 mm、冠状缝后1 mm处钻一直径约为2 mm孔，逐步扩大形成直径约6 mm的骨窗，暴露硬脑膜。尔后，将撞击装置的撞杆头端置于骨窗处，将撞击锤从30 cm高度自由落下，撞击撞杆，建立重度颅脑损伤模型，骨蜡封闭骨窗，缝合头皮［4］。对造模大鼠进行观察，确定造模成功后，治疗组大鼠腹腔注射3 mg/kg依达拉奉溶液，每12 h注射一次，连续治疗5 d;模型组大鼠仅给予等量生理盐水。对照组大鼠给予假手术处理:如上述操作对颅骨开窗，暴露硬脑膜，但不进行撞击，然后骨蜡封闭骨窗，缝合头皮，仅给予等量的生理盐水。分别于给药治疗后6 h、12 h、1 d、3 d、5 d 处死各组大鼠，开颅取出脑组织。以损伤部位为中心，将脑组织平均分成两份，称质量后置于液氮中备用。

1.3 脑含水量测定 取各时间点大鼠脑组织一份，于100℃恒温箱中干燥至恒重后，计算脑组织中的含水量，比较各时间点大鼠脑含水量的变化。

1.4 脑组织AQP4 mRNA的测定 取各时间点大鼠脑组织一份，在无菌条件下按照Trizol试剂盒说明书中方法提取脑组织总RNA，测定RNA含量;然后采用反转录试剂盒制备cDNA并进行PCR扩增。根据文献方法设计引物［5］:上游序列5'-TTGGACCATCATAGGCGC-3'，下 游 序 列 5'-GCATGTTGATCGACATTGACC-3'，扩增片段长 214 bp。PCR扩增程序:92℃变性2 min，56℃退火40 s，72℃延伸2 min，反应30个循环。产物用琼脂糖凝胶电泳检测，测定目的基因和内参GAPDH条带的光密度值，计算AQP4 mRNA表达的水平，比较各时间点大鼠脑组织AQP4 mRNA水平的变化。

1.5 统计学方法 采用SPSS12.0统计软件，结果用表示，比较采用q检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型大鼠观察 造模成功后，模型组挫裂伤灶处、蛛网膜下腔、皮质表面出现不同程度出血，随着时间延长出血症状持续加重，肿胀明显。3 d后，出血开始缓慢吸收，肿胀逐步减轻。治疗组出血及肿胀改善情况优于模型组，出血量较少，肿胀程度较轻，1 d后出血开始被吸收，肿胀减轻，3 d后充血水肿得到明显改善。

2.2 三组不同时间脑组织含水量变化 见表1。

2.3 三组不同时间脑组织AQP4 mRNA水平变化见表2。

3 讨论

表1 三组不同时间脑组织含水量变化(%，)

表1 三组不同时间脑组织含水量变化(%，)

注:与对照组同时间相比，*P＜0.05;与模型组同时间相比，△P＜0.05

组别 n 6 h 12 h 1 d 3 d 5 d对照组 5 63.28 ±1.43 64.82 ±1.21 63.87 ±1.09 65.79 ±0.98 64.77 ±1.56模型组 5 70.43 ±1.87* 74.61 ±1.45* 77.86 ±1.85* 80.95 ±2.75* 79.49 ±2.90*治疗组 5 68.49 ±1.44* 69.55±2.01＊△ 69.21 ±2.68＊△ 66.31±2.34△ 64.38 ±2.69△

表2 三组不同时间脑组织AQP4 mRNA表达(光密度比值，)

表2 三组不同时间脑组织AQP4 mRNA表达(光密度比值，)

注:与对照组同时间相比，*P＜0.05;与模型组同时间相比，△P＜0.05

组别 n 6 h 12 h 1 d 3 d 5 d对照组 5 0.783 ±0.067 0.769 ±0.081 0.772 ±0.063 0.786±0.081 0.794 ±0.093模型组 5 1.452 ±0.123* 1.573 ±0.141* 1.891 ±0.088* 1.804 ±0.213* 1.785 ±0.154*治疗组 5 1.265±0.154＊△ 1.195±0.162＊△ 1.107±0.153＊△ 0.856±0.095＊△ 0.815 ±0.099△

近年来，AQP4对脑水肿形成的影响一直是研究热点。AQP4是一类具有同源四聚体结构组成的膜通道蛋白家族，主要分布于脑表面的软脑膜、脑室系统的室管膜，特别是在与脑毛细血管紧密接触的胶质细胞和星形胶质细胞足突上高水平表达，为胶质细胞与脑脊液和血管间水分的转运和调节构建重要结构基础［1，5］。研究表明，脑组织中AQP4很可能是脑脊液重吸收以及脑水肿形成的分子生物学基础，而且脑出血后产生的大量氧自由基对脑水肿的形成也起着重要作用，这预示了AQP4膜蛋白与氧自由基之间可能存在某种联系。

新型自由基清除剂——依达拉奉在体内以阴离子形式存在，通过转移电子给自由基而发挥清除自由基和打断脂质过氧化反应链的作用，可抑制脑血管内皮细胞以及脑神经细胞的过氧化。药理研究已证实，依达拉奉能减轻各种模型动物脑缺血引起的脑水肿及组织损伤，保护作用明显［1］。本研究结果显示，依达拉奉可以明显降低创伤性脑水肿大鼠脑组织含水量以及AQP4 mRNA表达水平;治疗组大鼠各时间点水肿程度较模型组均有所降低，强度减弱;且连续给予依达拉奉治疗5 d后，脑组织含水量降为正常水平，比模型组大鼠降低约15%;脑组织AQP4 mRNA表达也接近正常水平，此时模型组大鼠的脑组织AQP4 mRNA表达水平是治疗组大鼠的一倍。其机制可能是依达拉奉有效阻断脑组织中自由基反应，减弱蛋白激酶C的磷酸化过程，抑制AQP4的表达上调，从而减轻脑水肿形成。

［1］汤崇辉，刘伟国.水通道蛋白4与创伤性脑水肿研究进展［J］.浙江创伤外科，2009，l4(1):84-86.

［2］陈垒，刘跃亭，段虎斌，等.小剂量多巴胺对大鼠颅脑创伤后水通道蛋白4表达的影响［J］.中西医结合心脑血管病杂志，2009，7(11):1319-1321.

［3］孙彬，衣服新，张树恒.依达拉奉对大鼠脑出血后水通道蛋白4及血脑屏障的影响［J］.辽宁医学院学报，2007，28(6):35-38.

［4］Feeney DM，Boyeson MG，Linn RT，et al.Responses to cortical injury:Methodology and local effects of contusions in the rat［J］.Brain Res，1981，211(1):67-77.

［5］King LS，Agre P.Pathophysiology of the aquaperin water channels［J］.Annu Rev Physiol，1996，58(6):619-622.