抗氯霉素单链抗体基因工程菌表达条件优化

四川理工学院 边名鸿 左 勇 陈欲云

氯霉素（CAP）是一种高效广谱的抗生素，在各种动物传染性疾病的防治方面得到了广泛的应用。但是其具有严重的毒副作用，长期微量摄入氯霉素不仅会使大肠杆菌、沙门氏菌等多种菌株产生耐药性，而且会引起动物机体正常菌群失调，抵抗力降低，易感染各种疾病（袁耀辉等，2008）。氯霉素在食用动物中的残留，可通过食物链在人体中富集，能引起人类的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症等疾病，因此，氯霉素在动物性食品中的残留对人类的健康构成了潜在危害。欧盟、美国等发达国家相继禁止或严格限制使用氯霉素。我国农业部也已禁止使用该药（滑静等，2003）。但由于氯霉素抑菌效果好，价格低廉，常被违法使用。因此，探索灵敏、高效、快速的氯霉素残留检测方法具有现实意义。

酶联免疫测定法（ELISA）作为一种食品中残留药物的检测技术，因其较好的敏感性和特异性，广泛应用于氯霉素残留检测上，国外已将此方法的试剂盒商品化。目前我国用于氯霉素残留检测的ELISA试剂主要来源于进口，价格比较昂贵，国内虽有一些采取杂交瘤技术生产抗氯霉素单克隆抗体的方法，但普遍存在着生产规模小、质量不稳定、生产成本高和难于放大生产等问题。基因工程单链抗体分子质量小，制备方法简单，能够通过基因改造来增强其亲和力和特异性，特别是易于放大生产 （沈倍奋等，2005），将其应用于ELISA检测中，则可以解决目前ELISA应用中的众多问题。本论文研究了基因重组单链抗体高效表达的影响因素，为下一步的研究和生产提供条件。

1 试剂与方法

1.1 实验仪器与试剂

1.1.1 实验仪器 SW-CJ-IF型净化工作台 （苏州安泰空气技术有限公司）；THZ-051型高精度数 控 摇 床 （SHENRGY BIOCOZOR公 司 ）；D-37520型台式冷冻高速离心机 （Thermo公司）；垂直板电泳槽、恒流电泳仪、凝胶扫描分析系统（上海天能有限公司）。

1.1.2 实验菌株和培养基 抗CAP单链抗体工程菌BL21菌株，本实验室保存。

LB培养基：0.5%胰蛋白胨，0.5%酵母抽提物，1% 氯化钠。

1.1.3 试剂 Tris、HCl、IPTG、SDS、 丙烯酰胺、EDTA、β-巯基乙醇、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、溴酚蓝、甘氨酸、NaCl、NaAc 等均购自广州威佳科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 生长曲线的绘制 取保存菌种，以1%的接种量接种在2 mL的试管培养基中，37℃，200 r/min活化过夜。第2天以1%的接种量接种在100 mL的三角瓶培养基中，37℃，200 r/min进行培养， 分别在 0、1、2、3、4、5、6、7 h 取 1 mL 培养液，用可见光分光光度计测OD600。以时间为横坐标、OD600为纵坐标，绘制工程菌的生长曲线。

1.2.2 诱导物的优化 取保存菌种，以1%的接种量接种在2 mL的试管培养基中，37℃，200 r/min活化过夜。第2天以1%的接种量接种在100 mL的三角瓶培养基中，37℃，200 r/min培养3 h后，分别加入IPTG、乳糖、别乳糖进行诱导，4 h后停止培养。各取100 μL菌液，5000 r/min离心5 min，弃上清。分别加入100 μL 2×上样缓冲液，100℃沸水浴煮沸5 min，12000 r/min离心5 min，取上清进行垂直板电泳。

1.2.3 诱导时机的优化 取保存菌种，以1%的接种量接种在2 mL的试管培养基中，37℃，200 r/min活化过夜。第2天以1%的接种量接种在100 mL的三角瓶培养基中，37℃，200 r/min分别培养至1.5、3、4.5 h时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），均诱导培养4 h后停止。各取100 μL菌液，处理方法与1.2.2中相同，进行SDS-PAGE检测。

1.2.4 诱导时间的优化 取保存菌种，以1%的接种量接种在2 mL的试管培养基中，37℃，200 r/min活化过夜。第2天以1%的接种量接种在100 mL的三角瓶培养基中，37℃，200 r/min培养至3 h加入IPTG诱导表达。从诱导0 h开始，分别在诱导 1、2、3、4、5 h 取样， 每次取 100 μL 菌液，处理方法与1.2.2中相同，进行SDS-PAGE检测。

2 结果与分析

2.1 工程菌的生长曲线 在100 mL的三角瓶培养基中，工程菌在37℃，200 r/min的条件下生长，其OD600随时间变化如表1。

表1 工程菌生长的OD600变化

以时间为横坐标，OD600为纵坐标绘制的生长曲线如图1。

图1 工程菌生长曲线

由图1可以看出，工程菌的生长规律在1.5 h进入对数生长早期，3 h进入对数生长中期，4.5 h进入对数生长末期，6 h开始进入稳定期了。

2.2 诱导物的优化 对于构建的抗CAP单链抗体基因工程菌BL21，使用三种诱导物进行诱导表达后，与空白宿主菌比较，在分子质量大约为28 kD处均有一新增条带，如图2所示。此大小与抗CAP单链抗体的理论大小相一致，判断为单链抗体目的蛋白。从图2中可以看出，在其他条件相同的情况下，三种诱导剂的诱导效果不同，使用IPTG作诱导剂，外源蛋白的表达量最高，扫描显示高达45%，其他两种诱导物的表达量分别为25%和35%，相比较IPTG的效果较好。

2.3 诱导时机的优化 基因工程菌生长和外源蛋白的表达是一种矛盾，外源蛋白的表达会影响工程菌自身的生长，所以选择合适的诱导时机对获得高的产量具有重要的意义。结合表2和图3中可以看出，培养3 h进行诱导，外源蛋白的表达量扫描显示达43%，菌体的生物量OD600值为4.010；培养1.5 h进行诱导，外源蛋白的表达量扫描显示高达52%，菌体的生物量OD600值为3.212；培养4.5 h进行诱导，菌体的OD600值为4.450，外源蛋白的表达量扫描显示只有33%。外源蛋白的总产量既与外源蛋白表达的百分比有关，也与工程菌的生物量有关，需从相乘的角度综合考虑，因此选择培养3 h后进行诱导表达较优。

图2 不同诱导物对蛋白表达的影响

表2 不同诱导时机下菌体的OD600

图3 不同诱导时机对蛋白表达的影响

2.4 诱导时间的优化 外源蛋白在宿主菌中的积累会随着时间而发生变化。一般会随着时间的进行，从零开始逐渐增多，直至达到一峰值，有些工程菌会维持峰值不变，有些会随着时间的进行，由于菌体内蛋白酶的作用，外源蛋白的表达量会转而降低。因此筛选出合适的诱导时间对获得高产、控制发酵进程有重要意义。 本试验中，抗CAP单链抗体基因工程菌诱导3 h的蛋白表达量为 35%，诱导4 h为 45%，诱导5 h为 40%，如图4。因此把诱导时间定为4 h是一个较好的选择。

图4 不同诱导时间对蛋白表达的影响

3 讨论与小结

基因工程产品的表达优化对于工业生产有着重要的意义。通过表达优化，可以为发酵生产提供良好的工艺条件，降低成本，提高经济效益，提高产品的竞争力（顾娟等，2010）。外源蛋白表达的影响因素较多，有培养基、培养温度、诱导物的种类、诱导物的浓度、诱导时机、诱导时间等，其中诱导物的种类、诱导时机、诱导时间是较为重要的三个影响因素（边六交等，2006）。本实验就此三个主要因素，对抗氯霉素单链抗体的高效表达进行了研究。实验中发现，三个因素均对表达有较大影响，最终选取IPTG作为诱导物、接种后培养3 h进入对数生长中期开始诱导、诱导4 h结束作为高效表达的优化工艺。

[1]边六交，杨晓燕，樊钰虎，等.重组鼠源角质细胞生长因子的发酵表达优化及纯化[J].中国医药工业杂志，2006，37（5）：314 ～ 317.

[2]顾娟，劳勋，金明飞，等.人胰高血糖素样肽-1突变体融合蛋白在大肠杆菌中的自诱导表达优化[J].微生物学通报，2010，37（5）：726 ～ 731.

[3]滑静，于同泉，孙英健，等.动物牲食品中氯霉素残留检测的研究进展[J].动物科学与动物医学报，2003，20（12）：36 ～ 37：.

[4]沈倍奋，陈志南，刘民培.重组抗体[M].北京：科学出版社，2005.21～37.

[5]袁耀辉，李锋，柴春彦，等.动物性食品中氯霉素残留检测技术进展[J].上海畜牧兽医通讯，2008，6：5 ～ 7.