推拿足三里、肾俞穴对阳虚模型大鼠外周血IL-2水平影响的实验研究

430061 湖北中医药大学针灸骨伤学院 樊云 甘水咏

430000 湖北省武汉市第十一医院 吴淼

430014 湖北省中山医院 何生华

中医学阳虚证的主要内在特征之一是机体免疫系统功能低下，外周血白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)水平是反映机体免疫系统功能状况的重要指标。大量临床实践显示，推拿疗法防治免疫系统功能低下类疾病具有良好的效果。但目前国内对中医药防治免疫系统功能低下类疾病的实验研究多集中在针灸、中药等方面，本研究尝试从穴位推拿的角度来探讨推拿疗法防治阳虚证的免疫学机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wister大鼠30只，6～7周龄，200～250 g[清洁级，湖北省实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK(鄂)2003-0005]，雌雄兼用。

1.2 主要试剂 大鼠IL-2定量ELISA试剂盒由上海森雄科技实业有限公司提供；醋酸泼尼松注射液(AHP)：125 mg/5 mL，浙江仙琚制药股份有限公司产品；黄芪注射液：20 g/10 mL，杭州正大青春宝药业有限公司产品；质量浓度为0.009 g/mL的氯化钠注射液，质量浓度为0.05 g/mL的葡萄糖注射液等。

1.3 主要仪器设备 XD711C型全自动酶标仪 (编号：01710318，上海迅达医疗仪器公司)、北京医用离心机厂LD5-2A型离心机、武汉市自动仪表厂TCS-200A型电子秤(量制鄂字01000127)、试管震荡器、电热恒温水箱、自制小型电动按摩治疗仪等。

1.4 实验过程

1.4.1 阳虚大鼠动物模型的建立 Wister大鼠每天每鼠按照3 mg/100 g体质量标准进行大腿肌肉注射AHP，连续5 d。大鼠出现拱背、蜷曲、肢尾冷、挤卧在一起、神疲、反应迟钝、被毛疏松、失去光泽、消瘦、少食、腰膝酸软(游泳存活时间缩短)、畏寒肢冷、精神不振、脱毛虚损状[1]。根据中医阳虚证辨证参考标准[2]，类似“阳虚”状态。

1.4.2 实验动物分组 将建立好的阳虚模型大鼠编号，根据随机分组表，分为生理盐水灌服对照组(A组)、黄芪注射液注射组(B组)、穴位推拿治疗组(C组)，共3组，每组10只，雌雄分养。

1.4.3 实验方法 A组大鼠每天每鼠用注射器灌服生理盐水3 mL，1次/d，连续2周；B组大鼠每天每鼠按照1 g/100 g体质量在大腿肌肉注射黄芪注射液，1次/d，连续2周；C组大鼠每天每鼠用自制小型电动按摩治疗仪在其足三里、肾俞两穴进行定量推拿，2次/d，每次每穴10 min，连续2周。经过测量，自制小型电动按摩治疗仪撞头叩击穴位的频率为240次/min，相当于推拿手法中的振动类手法，叩击穴位的力度为250 N/次。选穴：“足(后)三里”穴(双)，定位于后肢胫骨粗隆外膝至踝间上1/5处[3]；“肾俞”穴，定位，首先用手触摸到大鼠背部脊柱及两旁的肋骨，在肋骨结束的水平，定位第十二胸椎，然后往下数二个棘突，左右旁开10 mm(同身寸，大约为人体的1/10)即为“肾俞”穴[4]。

1.4.4 观察指标及检测 ①采用大鼠眼球摘除取血法取被检测大鼠新鲜全血2～3 mL，加入一次性EP管中。然后，各管中均加入50 μL 1%肝素钠作为抗凝剂，立即用力摇晃EP管，以充分抗凝。②各EP管上离心机低速(500×g)离心5 min，取上清液备用。③取试剂盒中的20×洗涤液，用蒸馏水1∶20稀释备用。④底物工作液配制：将大鼠IL-2定量ELISA试剂盒中的酶底物OPD片放入底物稀释液中溶解，每片加液5 mL。⑤标准品液配制：使用前每管加入蒸馏水100 μL溶解后即可。⑥将大鼠IL-2定量ELA试剂盒中的96孔微孔板取8孔作为标准孔，每孔中各加入样品稀释液100 μL，第1孔加标准品100 μL，混匀后用加样器吸出100 μL，移至第2孔。如此反复对倍稀释至第7孔，最后，从第7孔中吸出100 μL弃去，使之体积均为100 μL。第8孔为空白对照。⑦加样：在96孔板中取30孔作为待测品孔，每孔中加入待测大鼠新鲜全血离心后上清液100 μL。⑧将8孔标准孔板与30孔待测品孔板一起放置在反应板上，然后把反应板放入电热恒温水箱中37℃水浴120 min。⑨洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上印干。⑩每孔中加入第一抗体工作液50 μL。⑾将反应板放入电热恒温水箱中37℃水浴120 min。⑿洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上印干。⒀每孔中加入酶标抗体工作液100 μL。⒁将反应板放入电热恒温水箱中37℃水浴120 min。⒂洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上印干。⒃每孔加入底物工作液100 μL，置37℃暗处反应5～10 min。⒄每孔加入1滴终止液混匀。⒅把8孔标准孔板与30孔待测品孔板放入XD711C型全自动酶标仪中，将仪器项目名称调到IL-2，类型调到定量，测量方式调到终点法，波长调到492 nm，震动调到否，标准值调到1∶0.00，仪器即开始自动检测待测样品IL-2的水平。

2 实验结果及统计处理(表1)

所有计量资料结果用均数±标准差(x±s)表示，运用SPSS 11.1软件进行统计学处理。

表1 各组阳虚大鼠实验后外周血中IL-2水平(pmol/L)比较(±s)

表1 各组阳虚大鼠实验后外周血中IL-2水平(pmol/L)比较(±s)

分组 n 指标读数生理盐水灌服对照组(A组) 10 0.101 3±0.008 58黄芪注射液注射组(B组) 10 0.112 4±0.004 16★穴位推拿治疗组(C组) 10 0.113 4±0.004 70★▲

注：与A组比较，★P＜0.01，差异有高度统计学意义；与B组比较，▲P＞0.05，差异无统计学意义

3 讨论

祖国医学认为阳虚是由于阳气偏衰、正气不足、阴阳失调从而使机体呈现机能衰退、代谢活动减弱、热量不足的病理状态[1]。本实验用免疫抑制剂AHP注射液造成的“阳虚”模型可见大鼠萎靡不振、毛色无光泽、弓背少动、反应迟钝、腹泻等现象，此模型与邝氏等报道的一致[5]。研究显示阳虚证与机体免疫功能低下有关，而IL-2水平是反映机体体液免疫功能状况的重要指标。

IL-2在很多疾病的研究中不仅可以作为判断病情轻重和机体免疫状态的一个指标，也是目前国内外研究最为活跃、最清楚、最为广泛的一种细胞因子，它具有显著的免疫增强作用，不仅自身可促进T细胞增生分化和B细胞分泌抗体，增强NK细胞和CTL的杀伤力，还可与其他细胞因子如IFN-γ、TNF等一起发挥免疫功能[6]。从体液免疫角度看，IL-2在淋巴因子调节免疫反应的分枝网络中处于中心地位。因此，IL-2在机体的免疫应答和免疫调节中具有重要意义[7]。

阳虚证如何治疗？阳虚学说[8]认为治疗阳虚证的原则当用温补法。《灵枢·经脉篇》曰：“盛则泻之，虚则补之。”《素问·阴阳应象大论》曰：“形不足者，温之以气；精不足者，补之以味。”中医临床中常用的“扶正固本，补中益气”经典代表药物之一是黄芪。有研究[9-10]发现黄芪对IL-2有正向调节，促进分泌等作用。

中医学认为“阳虚”的病变机制一般多以脾肾阳虚为主。针灸学中足三里穴是气血“百川归海”之穴，是足阳明胃经的下合穴，有补益后天之要功。五脏之中的“肾”被称为“先天之本”。肾藏元气，中医理论的“正气存内，邪不可干”，气在人体有抵御各种病邪的功能，这与现代免疫学认为的免疫三大功能：防御、自稳、监视是相一致的。《素问·阴阳应象大论》曰：“肾生骨髓”，髓系肾之精气所化生，能滋养骨骼。肾俞穴为肾之背俞，是肾之精气聚集之处，为补肾之要穴。故本实验选择足三里、肾俞穴立论，并与黄芪进行对照。

我们的实验结果显示：阳虚模型大鼠经过足三里、肾俞穴量化推拿治疗后，与生理盐水灌服组比较，外周血中细胞因子IL-2水平明显上升(P＜0.01)；阳虚模型大鼠经过黄芪注射液肌肉注射后，与生理盐水灌服组比较，其外周血中细胞因子IL-2水平明显上升(P＜0.01)；足三里、肾俞穴量化推拿治疗法与黄芪注射液肌肉注射法在提高阳虚模型大鼠外周血细胞因子IL-2的水平方面差异均无统计学意义(P＞0.05)。由此可见，推拿足三里、肾俞穴，可以提高阳虚大鼠外周血IL-2水平，增强阳虚大鼠免疫能力。

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