不同基因型甘草品质及产量的比较

柴 娜,张 颖,王景安

(天津市细胞遗传与分子调控重点实验室,天津300387)

甘草(Glycyrrhiza uralensis)具有耐旱、耐盐[1]、耐沙埋等特性,固沙能力强,是维护我国西部荒漠、半荒漠草原地区生态环境的重要植物[2]。其根茎可入药,具有补脾益气、止咳祛痰、清热解毒、调和诸药的功能,素有“十药九草”之美称。主治脾胃虚弱,倦怠乏力,咳嗽痰多,痈肿疮毒,缓解药物毒性、烈性[3]。其茎叶富含营养成分,可作为优质牧草应用于畜牧业[4]。此外,甘草还广泛应用于食品、日用化工等领域[5]。随着甘草应用范围的扩大,甘草和甘草制品的需求量呈猛增趋势,野生甘草资源日益减少,供求矛盾十分突出,通过人工栽培甘草来满足市场需求已成为最佳选择,但目前缺乏优良的栽培品种,严重制约着栽培甘草的质与量。从现有野生群落或栽培群体中筛选药材质量优良的变异类型,培育成优良品种的方法是最为快速有效的途径[6]。本研究以天津师范大学试验地种植的四年生乌拉尔甘草为材料,对不同基因型甘草的产量、药用成分含量及可溶性糖、氨基酸、蛋白质等成分含量进行分析,以期筛选出高产优质的类型,并对其机理进行探讨。

1 材料与方法

1.1 试验材料 以天津师范大学试验地乌拉尔甘草为试验材料,种子购自北京时珍中草药技术(集团)有限公司。

试验地材料按植株茎表皮颜色分为紫红植株、绿色植株;按植株高度分为高大植株(株高大于150 cm)、低矮植株(株高小于120 cm)。从中选取9株,编号,截取根茎繁育成株系,选择生长状况接近的幼苗移入Hoagland营养液中培养,每一株系栽种10棵,每5 d更换一次营养液,培养50 d后测定分析。

1.2 试验方法

1.2.1 生物量相关数据的测定 测定不同基因型甘草的株高、地上部分鲜质量及根鲜质量。杀青并烘干至质量不变后测定其地上部分干质量及根干质量。分别将根、叶粉碎,过60目筛,保存于干燥器内备用。

1.2.2 甘草酸含量的HPLC测定 色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm ×4.6 mm,5 μ m)。以乙腈为流动相A,0.05%磷酸溶液为流动相B,按中国药典[7]中的规定进行梯度洗脱。进样量为10 μ L,柱温 30 ℃,流速 1.0 mL/min,检测波长250 nm。

以体积分数0.5%氨水与体积分数10%乙醇的溶液为提取剂[8],参照文献[9]方法提取甘草酸。按上述HPLC条件测定不同供试样品溶液峰面积,并根据与对照峰面积的比值计算其甘草酸含量。

1.2.3 甘草黄酮、甘草多糖含量的测定 采用超声法[10]提取甘草黄酮。提取液加入质量分数为10%的KOH显色后测定其吸收值[11]。根据回归方程,计算样品的黄酮含量。

按1∶30固液比加入蒸馏水,超声提取甘草多糖[12-13]。采用苯酚-硫酸显色法[14]测定不同样品甘草多糖含量。

1.2.4 可溶性糖、淀粉含量的测定 可溶性糖及淀粉提取及测定方法参见文献[15]。

1.2.5 氨基酸含量的测定 测定可溶性糖的提取液,也可用作游离氨基酸的测定[16],测定方法为茚三酮显色分光光度法[17]。

1.2.6 蛋白质含量的测定 采用直接提取法[18]提取蛋白质,加入100 mg/L考马斯亮蓝G-250溶液显色后测定[17]。

1.3 数据处理与分析 所有测定均重复3次。利用Excel 2003软件处理基础数据,用SPSS 13.0软件对数据进行方差分析。

2 结果

2.1 不同基因型甘草生物量的比较 不同基因型部分甘草株高和地上干质量均存在显著差异(表1)。8号植株株高近70 cm,显著高于矮类植株(P＜0.05),其地上部分干质量亦显著高于其他植株(P＜0.05);2号植株最矮小,株高仅31 cm,其地上部分干质量亦最低。根作为甘草的药用部分,其产量高低尤为重要。7号和8号植株根产量在0.2 g以上,而其他植株根产量都未达到0.2 g/株,有的甚至低于0.1 g/株。地上部分生长旺盛者,利于植株的光合与干物质积累,因此根产量亦高。从可见的表观性状与产量的关系来看,高大绿茎植株的根产量高于矮小紫茎植株,但它们的根含水量没有显著差异(P＞0.05)。

2.2 不同基因型甘草药用成分含量比较 不同基因型甘草中甘草酸、甘草黄酮、甘草多糖含量均有显著差异(表2)。甘草酸含量变化在0.118%～0.295%,其中,4号植株甘草酸含量显著高于其他植株(P＜0.05);8号和3号植株的甘草黄酮含量均在0.3%以上,显著高于除9号以外的其他植株(P＜0.05),含量最低者仅0.189%;甘草多糖含量变化较大,在0.448%～2.907%,最低者不足最高者的1/6。以甘草酸含量为主,综合考虑甘草黄酮及多糖含量,2号、4号和8号为3个品质优良的植株,而5号和7号植株3种药用成分含量均很低,品质较差。不难发现,甘草品质的优劣与茎秆颜色及植株高矮没有必然的联系。

表1 不同基因型甘草株高、干质量及含水量比较

表2 不同基因型甘草甘草酸等药用成分含量比较%

从每株的甘草酸产量来看,8号植株最高,为0.450 mg/株 ,1 号植株最低 ,仅 0.141 mg/株,不足前者的1/3。可见,8号植株是甘草酸含量高(即品质好)且产量高的优良植株。另外,7号植株的甘草酸含量相对偏低,但其产量最高,计算得甘草酸的单株产量为0.315 mg,仅次于8号植株,亦属较高类型。由此可见,要从现有野生群落或栽培群体中筛选优良植株,不仅要考虑其品质,产量也是一个重要因素。只有甘草酸含量和植株产量都达到一定标准,如本研究筛选出的8号植株,才是生产上需要的优质类型。

2.3 不同基因型甘草糖类物质含量比较 不同基因型甘草根可溶性糖含量见表3。4号植株含量显著高于其他植株(P＜0.05),为18.336%,植株合成糖的能力强,其甘草酸含量最高但产量低,可能的原因是糖类高效地向次生物质转化,而向构建植物体物质的转化相对较少。9号植株可溶性糖含量为16.034%,也属较高类型,但与4号植株相反,其甘草酸含量不高但产量高,糖类高效的向构建植物体的物质转化,向次生物质转化较少。5号植株根可溶性糖含量显著低于其他植株(P＜0.05),仅4%,3号和8号植株的含量在7%左右,也属于较低类型。在营养物质如氮等的供给水平相同的条件下,不同基因型甘草通过光合作用合成糖的能力不同,糖类经过一系列反应转化成其他物质的能力也不同。糖含量低,可能是自身合成糖的能力差,也可能是植株体内糖类向其他物质转化的多。5号植株品质差,产量也不高,究其根源是5号植株合成可溶性糖的能力本身就差,向其他物质的转化自然就少,3号植株亦是如此;而8号植株合成糖类的能力较强,糖类向构建植物体的物质和向次生物质的转化效率高,所以植株的品质好产量也高。3号植株根淀粉含量较2号植株高,但与其他植株相比没有显著差异,说明不同基因型甘草淀粉储存量与其产量和品质没有密切关系。

部分基因型甘草叶中可溶性糖、淀粉含量差异达到显著水平(表3)。观察发现,叶中可溶性糖和淀粉含量随甘草产量的增加而降低,说明高产类型具有高效的将糖类向构建植物体物质转化的特点,这可能是高产的主要原因。

表3 不同基因型甘草可溶性糖和淀粉含量比较 %

2.4 不同基因型甘草蛋白质及氨基酸含量比较 不同基因型甘草根中蛋白质含量见表4。5号和1号植株的含量在5 mg/g以上,显著高于其他植株(P＜0.05),2号植株的含量显著低于其他植株(P＜0.05),为3.839 mg/g。优质高产的8号植株蛋白质含量为4.365 mg/g,属居中类型,表明此株系在保持生长和积累有效药物成分方面达到了较好的平衡。根中氨基酸含量变化在16.678～34.223 mg/g,8号植株氨基酸含量为26.678 mg/g,属中间类型,表明此株系将糖转化为氨基酸及氨基酸合成蛋白质协调性很好,保证了它具有较高的产量。

除4号植株含量显著高于其他外,不同基因型甘草叶中氨基酸含量差异不显著(P＞0.05)。而由氨基酸合成的蛋白质含量在叶中有显著差异(P＜0.05)。其中1号和4号植株的蛋白质含量显著高于其他植株,均在7 mg/g以上,6号植株的蛋白质含量显著低于其他植株,为5.066 mg/g(表4)。

值得注意的是,2号植株根中氨基酸含量很高,但合成的蛋白质的量却最少,其叶中氨基酸及蛋白含量也体现同样的趋势。说明该基因型甘草由氨基酸向蛋白的转化过程缓慢,此过程缓慢必然导致植株生长受抑,故植株矮小。虽然2号植株矮小,但其甘草酸含量并不低,因其生长速度慢,其积累的次生代谢物质多,体现了浓缩效应。

表4 不同基因型甘草蛋白质和氨基酸含量比较 mg/g

3 讨论与结论

甘草在Hoagland溶液培养条件下,生长情况与大田基本一致,所以完全可用溶液培养的方法研究大田的情况。

甘草酸、甘草黄酮类、甘草多糖类化合物是甘草的主要药用成分,其含量是判断甘草质量的重要指标。牛小宇等[19]的研究表明,相同环境下甘草酸含量变异很大,与本研究得到的结果相同。杨全等[20-21]的研究表明,在甘草形态变异类型中,绿茎茎光滑类型甘草的甘草酸、总黄酮含量显著高于其他形态变异类型,紫红茎茎光滑类型、紫红茎基茎光滑类型多糖含量最高。但本研究发现,药用成分含量高的植株,并没有集中于某一基因型,甘草品质的优劣与植株高矮及茎表皮颜色没有必然的联系。

本研究从初生代谢物质与甘草酸等次生代谢物质的转化和相互关系的角度探讨优质高产甘草形成的机理。认为只有合成糖的能力强,并将糖高效、协调的转化为构建植物体的物质和次生代谢物质,才能得到优质高产的植株,也只有品质和产量都达到一定标准,才是生产上需要的优质类型。

本研究选出的品质好产量高的株系(8号),其产量达到了最低产量株系的近3倍,甘草酸含量是含量最低者的1.6倍,可以作为优良品种进行选育。将其经快繁大面积栽培,可明显提高甘草产量和质量,有效缓解我国甘草资源短缺状况,具有重要的现实意义。

[1] 张剑云,陈水红,魏萍.塔里木河流域4种野生豆科植物种子耐盐性研究[J].草业科学,2009,26(6):116-120.

[2] 安力,河西沙区甘草资源的保护与发展[J].甘肃林业科技,1997(1):48-51.

[3] 马丽萍,常智善.沙漠干旱地区人工栽培甘草主要栽培因素相关性及其与产量的关系[J].草业科学,2007,24(4):47-49.

[4] 张继,刘阿萍,曾家豫,等.胀果甘草茎叶营养成分的分析研究[J].草业学报,2003,12(2):93-96.

[5] 张继,姚健,丁兰,等.甘草的利用研究进展[J].草原与草坪,2000(2):12-17.

[6] 陈秀华,魏胜利,王文全.种质资源与中药材质量[J].中药研究与信息,2003,5(4):11-14.

[7] 国家药典委员会.9787506744393中国药典[S].北京:中国医药科技出版社,2010.

[8] 王巧娥,沈金灿,于文佳,等.甘草中甘草酸的微波萃取[J].中草药,2003,34(5):407-409.

[9] 李剑君,国蓉,莫晓燕,等.甘草酸提取工艺的优化研究[J].食品科学,2006,27(12):326-330.

[10] 李炳奇,汪河滨,李学禹,等.超声法联合提取甘草黄酮和甘草酸的研究[J].山东中医杂志,2005,24(1):38-40.

[11] 闫永红,王文全,杨娜.栽培甘草中总黄酮的含量测定[J].中国中药杂志,2006,31(12):1019-1021.

[12] 刘霞,谢建新,李艳,等.甘草多糖的超声提取及含量分析[J].西北药学杂志,2004,19(2):60-61.

[13] 李春英.甘草多糖提取纯化工艺研究[D].哈尔滨:东北林业大学,2002.

[14] 刘金荣,赵文彬,江发寿,等.不同生长期栽培甘草中多糖的含量测定[J].中成药,2005,27(6):708-710.

[15] 刘长利.甘草酸在甘草植物体内积累的调控机制研究[D].北京:北京中医药大学,2005.

[16] 邹琦.植物生理生化试验指导[M].北京:中国农业出版社,1995:56.

[17] 白宝璋,王景安,孙玉霞,等.植物生理学(Ⅱ)——测试技术[M].北京:中国科学技术出版社,1993:88-89,99-100.

[18] 谷瑞升,刘群录,陈雪梅,等.木本植物蛋白提取和SDS-PAGE分析方法的比较和优化[J].植物学通报,1999,16(2):171-177.

[19] 牛小宇,刘春生,崔浩然.栽培甘草群体中不同单株甘草酸的含量差异研究[J].时珍国医国药,2009,20(9):2121-2122.

[20] 杨全,王文全,魏胜利,等.不同变异类型甘草中甘草苷及甘草酸量比较研究[J].中草药,2007,38(7):1087-1090.

[21] 杨全,王文全,魏胜利,等.甘草不同类型间总黄酮、多糖含量比较研究[J].中国中药杂志,2007,32(5):445-446.