抗结核分枝杆菌感染的免疫机制

姚翠梅,孙长江,雷连城,韩文瑜

(吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春,130062)

据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)统计,全世界约有 20亿人感染结核分枝杆菌,每年约有 880万新发病例,200万人因结核病而死亡,每 15 s就会有一个死亡病例。并且,随着社会人员流动,HIV感染者增多造成的交叉感染使我国的结核病感染率一直处于上升趋势,已经成为造成全球人类死亡的主要传染病类型[1,2]。虽然全球有 1/3的人口感染结核分支杆菌,但只有 10%发展成为肺结核[2]。近几年由于耐多药结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的出现,给结核病的治疗又提出了一大难题。至今,全球预防结核病的疫苗只有卡介苗(BCG)一种,但是近来发现此种疫苗对于成人结核病的预防几乎起不到作用,对于幼儿的预防也存在一定的危险性。因此,了解宿主的免疫系统及机体相关细胞与病原菌的相互作用机制非常重要,并且能对结核病的预防和治疗提供一定的帮助。

1 非特异性免疫

1.1 巨噬细胞与结核分枝杆菌相互作用

巨噬细胞是由骨髓中分化成熟的单核细胞进入血液,然后随血流随机分布到全身多种组织器官分化成熟而来。巨噬细胞寿命长,具有较强的吞噬功能,是MTB的最主要的靶细胞。组织中的巨噬细胞可以吞噬多种病原微生物并处理衰老死亡的组织,其自身还能分泌多种细胞因子和其他炎性介质参与局部炎症反应、发热反应等。巨噬细胞可以通过氧依赖性和非氧依赖性杀菌系统发挥杀伤和消除病原菌的作用。此外,它还可以加工处理递呈抗原,启动特异性免疫应答以及抗肿瘤等作用。

巨噬细胞有两种识别MTB的方式:①直接识别 巨噬细胞能通过其表面的激素样受体直接识别侵入机体的 MTB。在这些受体中,Toll样受体(Toll2like recep tor,TLR)在MTB中的作用受到广泛关注,其中 TLR 2更重要。结核分枝杆菌19-kD脂蛋白能被 TLR2识别,持续刺激巨噬细胞能降低 IFN-γ诱导的 MHCⅡ类分子的表达[3]。最新研究表明,还存在TLR 2非依赖途径[4]。②间接识别 巨噬细胞可以通过表达补体受体识别 MTB。Daniel等[5]研究发现,补体 C5缺失的小鼠由于活性氧的合成和递送障碍,杀灭MTB的能力减弱。Rooyakkers等[6]发现,补体受体 3剔除的小鼠巨噬细胞对MTB的黏附和吞噬作用降低。

巨噬细胞是 MTB进入机体内首先侵入的细胞,是MTB感染过程中的主要靶细胞。巨噬细胞能通过自身凋亡等杀灭菌体。巨噬细胞系统的细胞毒素具有两个系统:一个是氧依赖系统,在抗微生物效应中起决定性的作用;另一个是氧不依赖的系统,溶菌酶等属于该系统产物,这个系统也参与杀微生物活性。巨噬细胞主要通过氧依赖系统杀伤侵入机体的 MTB,激活的巨噬细胞发生呼吸暴发,产生反应性氧中间产物(ROIs)和反应性氮中间产物(RNIs),释放溶菌酶等活性蛋白质,这些物质有强的氧化作用和细胞毒作用,对MTB有强的杀伤作用。另外,巨噬细胞与病原菌作用后处于激活状态的巨噬细胞可以通过病原菌与 TLR相互作用激活 caspase-8,诱导其自身凋亡,破坏 MTB的生存环境,杀灭入侵的MTB。

在特异性细胞免疫应答中,巨噬细胞可以作为免疫递呈细胞,通过吞噬、摄取外来抗原经过胞内酶将其降解为抗原多肽,在其内与内质网运来的MHCⅡ类分子结合,形成抗原肽与MHCⅡ类分子的复合物,然后被高尔基体运送至抗原递呈细胞表面,供CD 4+TH细胞识别,刺激机体做出保护性应答。

MTB能在巨噬细胞内定居存活以及引起机体一系列的病理反应是与其免疫逃逸的机制分不开的。MTB进入巨噬细胞胞膜内化形成吞噬小体,然后与溶酶体结合形成吞噬溶酶体,溶酶体分泌的胞内酶可以促使吞噬溶酶体酸化,外源性抗原在吞噬溶酶体的酸性环境中被水解为抗原多肽。而MTB之所以能够在巨噬细胞内存活是因为它能够阻止吞噬溶酶体的酸化。MTB可以通过降低磷脂酶D的活性,下调MHCⅡ的表达,抑制吞噬溶酶体的成熟进而抑制巨噬细胞的氧依赖杀伤作用。Auricchio等[7]研究发现,CpG寡脱氧核苷酸可通过增强磷酯酶D的活性,增强巨噬细胞对 MTB的反应,恢复巨噬细胞的天然防御机制。

复旦大学免疫生物所[8]曾用不同剂量的热灭活结核分枝杆菌H 37Rv(0,5,50,150,500mg/L)刺激BMDM 24 h后,再给予 IFN-γ(20μg/L)刺激 24 h,发现给予结核分枝杆菌刺激后,IFN-γ诱导的 MHCⅡ类分子表达降低,且呈剂量依赖性。如果持续刺激 TLR,机体会产生负调控,抑制过强的炎症反应,如出现内毒素耐受等。结核分枝杆菌在机体内能长期存在,可能就是通过这种负调控机制,抑制IFN-γ诱导的巨噬细胞抗原呈递功能,降低适应性免疫应答,从而产生免疫逃逸。

1.2 γδT细胞与结核分枝杆菌的相互作用

结核分枝杆菌侵入机体后首先遇到非特异性免疫机能的抵抗,其中以巨噬细胞吞噬和炎症反应为主。对于 MTB主要参与非特异性免疫的细胞除了巨噬细胞,还有γδT细胞。

T淋巴细胞根据其表面抗原识别受体类型不同,分为包含 α,β链的 αβT细胞和包含 γ,δ链的 γδT细胞。 γδT细胞占外周血 T细胞的 0.5%～10%,主要分布在一些器官与外界相通处,如肺、上皮、黏膜免疫系统等。它对靶细胞的作用无专一性,无MHC限制性。

陈勇等[9]通过对结核杆菌耐热多肽抗原MTB-Ag的蛋白组成进行定性分析,并观察了MTB-Ag及其纯化组分刺激人外周血 γδT细胞和 αβT细胞增殖反应的量效关系。得出如果有合适刺激剂量的MTB-Ag刺激,其所含的低分子多肽抗原能特异性激活 γδT细胞,而其所含的大分子蛋白抗原则特异性激活 αβT细胞。Hoft等[10]通过流式细胞计数仪发现,卡介苗接种组与非致敏的对照组相比,人类 γδT细胞明显增多,并且以 γ9+δ2+T细胞为主。γ9+δ2+T细胞可以通过颗粒依赖性机制削弱胞内杆菌的生存能力,杀死寄存 MTB的巨噬细胞。在杀死被感染的巨噬细胞及 MTB时,穿孔素起了重要作用。

1.3 树突状细胞

树突状细胞(Dendritic cells,DC)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞,他能高效的摄取、加工处理和递呈抗原,未成熟 DC具有很强的迁移能力,成熟的DC能有效的激活初始型T细胞,处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。树突状细胞尽管数量不足外周单个核细胞的 1%,但表面具有丰富的抗原递呈分子(MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ)、共刺激因子(CD 80/B7-1,CD 86/B 7-1,CD40,CD 40L等)和粘附因子(ICAM-1,ICAM-2,ICAM-3,LFA-1,LFA-3等),是功能强大的专制抗原递呈细胞。DC具有免疫刺激能力,是目前发现的能激活未致敏的初始型T细胞的抗原递呈细胞。

目前,分支杆菌肉芽肿中存在的DCs越来越受到关注。其中单核细胞衍生的 DCs是主要的单核细胞亚群,这个谱系中的细胞表面趋化因子受体主要包括CCR2,CCR 5及CCR6。研究发现,CCR 2高表达的小鼠可以加速免疫应答过程,而 CCR 2缺失的小鼠对于高剂量的结核分支杆菌(2×105CFU)易感,而对于低剂量的结核分枝杆菌(50～100 CFU)有一定的耐受性,延迟感染速度[11]。CCR 5缺失的小鼠在肺部引流淋巴结处发现相对较多的 DCs,说明 CCR 5的表达有助于保留DCs在肉芽肿区。表达CCR 7,CCR 8受体的单核细胞能促使分支杆菌由受损组织到引流淋巴结迁移。分支杆菌的吞噬体与机体生物合成途径也受到DCs的控制,并且能够阻止结核分支杆菌生长必须的营养的吸收[12,13]。这些研究表明,DCs在多种趋化因子存在时,可以移行到或者移行出肉芽肿。DCs对于感染细菌从受损组织或者肉芽肿区抗原移行到引流淋巴结,以便保持连续的T细胞引发反应方面起着关键作用。

2 特异性免疫

MTB作为一种胞内寄生菌,机体主要通过细胞免疫将其杀灭清除。首先抗原递呈细胞的对抗原的递呈,经过致敏阶段、反应阶段、T细胞分化为效应淋巴细胞并产生细胞因子,从而发生免疫效应。

TH细胞根据所产生细胞因子的不同分化为不同的Th细胞亚群。IL-2与IL-2R结合是促进T细胞增殖的一个条件。成熟的 Th0在 IL-12作用下分化为 Th1细胞,在 IL-4作用下分化为 Th2细胞。Th1细胞分泌 IFN-γ,IL-12,TNF-α等细胞因子参与细胞免疫应答,其中IFN-γ能有效激活巨噬细胞,促巨噬细胞杀灭进入细胞内的病原菌。诱导 M f高表达B7和MHCⅡ类分子,促进抗原的加工和提呈。促进 CTL分化,辅助 B细胞产生调理性抗体。Th2细胞分泌 IL-4,IL-5,IL-13参与免疫应答,主要功能为促进B细胞发育和介导体液免疫应答。在Th1细胞辅助下(或以非 Th1细胞依赖方式),初始CD8+T细胞分化成 CTL(活化的 CTL)。效应 CTL分泌穿孔素(perforin)和粒酶(granzyme),穿孔素在靶细胞膜上形成孔道,使细胞裂解。颗粒酶通过孔道进入细胞,激活凋亡相关酶系统介导靶细胞凋亡。效应 CTL表达 FasL,分泌 TNF-α,TNF-β,激活caspase信号转导途径,诱导靶细胞凋亡。目前认为 Th1细胞产生的细胞因子对于宿主抵抗 MTB的感染起主要作用,Th2细胞的作用还备受争议[14～17]。

刘来成等[18]用 H 37Ra免疫小鼠,活化T细胞增殖,刺激产生高水平的 Th1型细胞因子 IFN-γ,Th2型细胞因子 IL-4的水平也高于生理盐水对照组,但IFN-γ升高较 IL-4更明显,说明H 37Ra免疫小鼠后在体内诱导的特异性免疫反应以Th1型为主。特别是细胞因子IFN-γ的参与,充分的证据表明,不同的 T细胞群包括 CD4+,CD 8+T细胞等都有参与到抵制 MTB的保护性免疫应答中[19]。胥萍等[20]通过流式细胞技术分析了初诊肺结核患者外周血中 CD 4+T淋巴细胞及其亚型Th1和 Th2细胞亚型的改变,以便对结核病变过程的研究提供一定的标准。结果发现,初诊肺结核 Th1细胞含量低于健康对照组、粟粒型肺结核Th1细胞含量显著低于浸润性肺结核。相反,与健康对照组相比,Th2细胞亚群却有显著升高。

另外,MTB侵入机体后,对 Treg及 Th17的研究发现,Treg和 Th17在针对 MTB的细胞免疫中有相反作用[21]。Treg抑制 Th1,Th2的免疫反应,可以通过产生肿瘤生长因子(Tumour growth factor,TGF)β,抑制 Th17的出现。TGF-β能通过缓冲促炎症反应,保护机体组织免受损伤,对于持续受MTB刺激的组织,降低了机体对 MTB的应答,而 Th17有强烈的前炎症反应。减少 Treg和增加Th17能够通过刺激机体细胞免疫应答而增加机体的保护作用。

Manuela Grassi等[22]通过对人肺泡中 847个基因的分析发现,当机体感染 MTB后,IFN-γ以及与控制 IFN-γ产生的相关基因都有增量调节,还有部分促使细胞凋亡的基因也呈现不同程度的调节。另外一部分趋化因子象IL-8,MIP-1β,MIP-1α,MCP-1以及 GM-CSF-R在 60%结核病人体内也都发现有增量调节[23,24]。

MTB的抗原性物质分别经MHCⅡ类和MHCⅠ类分子途径激活机体的CD4+TH细胞和CD 8+TCL细胞,分别识别外源性抗原和内源性抗原。CD4+TH细胞和CD 8+TCL细胞在抵抗 MTB感染中均发挥着重要作用。活化的 CD 4+TH细胞产生 IFN-γ和 IL-2等细胞因子,其中 IFN-γ可充分活化巨噬细胞,促其杀伤胞内吞噬的 MTB。CD 8+TCL细胞通过识别靶细胞,释放穿孔素或颗粒溶素(Granu lysin)等诱导细胞溶解凋亡,破坏 MTB生长环境,使新增抗原递呈而起到免疫监视的作用。另外,CD 8+TCL细胞也能够分泌 IFN-γ。IFN-γ尽管在抵抗 MTB感染中不是唯一的因素,但却是一个很关键的因素。IFN-γ的产生需要细胞因子 IL-12的刺激,而 IL-12是有树突状细胞在 MTB与 TLR作用后产生[25]。这也在单核巨噬细胞和 T细胞之间提供了一个桥梁纽带的作用[26]。

3 结 语

机体对于抵抗 MTB感染的免疫机制是一个复杂而精密的过程,他不仅需要各种免疫细胞的参与,还需要各种细胞因子的刺激作用。各种免疫细胞之间不是孤立的起作用而是相互联系在一起,如何控制机体向有利于清除MTB和增强机体免疫作用的方向发展将是今后研究结核病预防与治疗的重点。随着分子生物学、细胞生物学及免疫学的发展,对抵抗 MTB感染的免疫机制的揭示将会更加清晰,进而对于结核病的预防和治疗也会提供很大的帮助,结核病的攻克也将不是难题。

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(责任编辑:朱宝昌)