细胞自噬提高抗原呈递细胞内抗原呈递效率的研究进展

赵娅娅,潘风光,孙长江,雷连成,韩文瑜,李洪山

(吉林大学军需科技学院,吉林长春,130062)

细胞自噬是普遍存在于真核细胞中的细胞生物学行为,巨噬细胞和 DC细胞是可以将细菌性或其他颗粒性抗原吞噬到吞噬小体内的吞噬性抗原呈递细胞。吞噬小体必须平衡它的能杀灭微生物与降解蛋白功能与通过 MHCⅡ产生抗原肽片段,并将其分别呈递给CD4细胞的功能。

树突细胞和巨噬细胞是联系先天性免疫和适应性免疫的吞噬性抗原呈递细胞。抗原呈递细胞通过内吞作用将细菌、真菌和寄生虫吞到吞噬小体内,同时在吞噬小体内通过对微生物抗原进行蛋白酶解加工产生抗原肽段,接着这些肽段由MHC-Ⅰ和 MHC-Ⅱ分子呈递给 T细胞。MHC-Ⅰ分子对细胞外或空泡内的微生物,即外源性抗原的呈递被看做是 MHC-Ⅰ分子的交叉作用,这点与传统意义上的 MHC-Ⅰ分子交叉作用有区别,在传统意义上 MHC-Ⅰ分子交叉作用是针对细胞质和吞噬小体内的抗原。因此,吞噬小体和先天性免疫反应和适应性免疫有关,适应性免疫包括细胞免疫和体液免疫。

1 细胞自噬

细胞自噬是普遍存在于真核细胞中的细胞生物学行为,自噬作用在生物体生长发育、细胞分化及对环境应激的应答方面极为关键。在胞内感染细菌和病毒感染宿主细胞的过程中,自噬一方面能促进感染细胞对病原体的清除;另一方面,胞内感染病原体通过某些机制逃避细胞的自噬作用,与胞内感染的致病机制有关。

自噬性细胞死亡的现象早在 20世纪 60年代就已被发现,它是指细胞内的溶酶体降解自身细胞器和其他大分子的过程。当细胞在缺乏营养或发生应激反应时,可发生细胞自噬现象(autophagy)。细胞开始自噬时,细胞质中形成大量由双层膜包裹着的待降解物质的泡状结构,称自噬小体(autophagosome)。随后,自噬小体与溶酶体发生融合形成自噬溶酶体,自噬泡所包裹着的待降解物质在溶酶体所含酶的作用下分解成氨基酸和核苷酸等,并进入三羧酸循环,产生小分子和能量(ATP),再被细胞所利用。因此,长期以来细胞自噬被认为是细胞的自救行为,溶酶体参与其中的全过程,其在生理过程的作用大体可以分为3种:参与细胞的发育和分化过程;营养缺乏时产生氨基酸;清除不需要的和损伤的细胞器与分子[1]。

近来研究发现,细胞自噬在胞内感染性病原体的防御机制方面也发挥重要作用。一方面,胞内感染性细菌和病毒在逃脱非吞噬细胞的内吞体后,可被自噬体内化、降解,从而促进细胞对胞内感染的病原体的清除[2];另一方面,胞内感染病原体通过某些机制逃避宿主细胞的自噬,与胞内感染性病原体的致病机制有关[3～8]。

1.1 胞内感染性细菌与细胞自噬

最近研究表明,细胞自噬是对抗胞内细菌感染最有效的武器。通常情况下,胞内细菌被宿主细胞内吞后进入胞浆,宿主细胞会启动自噬途径,自噬小体将其包裹,并运送到溶酶体中降解。

目前认为,胞内感染性细菌的致病机制可能与病原体入侵细胞后干扰细胞的自噬过程有关:干扰自噬体与溶酶体的融合避免被降解;通过分泌某种蛋白延缓自噬体向自噬溶酶体的转变从而停留在自噬体样结构的囊泡中复制;在免疫系统的巨噬细胞中分泌的蛋白促进自噬体样结构的形成;或者干扰自噬体的成熟,促进自身的存活。

结核分枝杆菌是一种胞内感染病原体,其致病机制可能与干扰自噬体与溶酶体的融合、抑制自噬途径使得自噬体中的结核分枝杆菌不被降解等有关。Gutierrez等[3]发现,采用饥饿或雷帕霉素(rapamycin)上调宿主细胞的自噬时,结核杆菌会被转运到感染细胞的溶酶体中降解,雷帕霉素的药理刺激使得吞噬小体的生成聚集从而促进自噬。

同时发现,自噬相关基因产物 Beclin-1刺激吞噬小体的聚集,Beclin-1是 hVPS34-PI3K(人类空泡蛋白 34-磷脂酰肌醇3激酶)复合体上的促进自噬的亚基,含有结核分枝杆菌的吞噬体与Beclin-1相连接,促进含菌空泡体的发生自噬,从而使得结核杆菌减少。

LC3(微管相关蛋白轻链-3)是唯一被发现的自噬体特征性标记,定位在自噬体的双层膜上。Gutierrez等[3]还发现,加入IFN-γ不仅使巨噬细胞的LC3含量发生变化,而且结核杆菌与LC 3发生共同定位现象,自噬的诱导使得胞内生存的成熟结核杆菌减少,该共同定位现象能被自噬阻断剂(3MA,wortmannin)所拮抗,提示IFN-γ抗结核菌的效应可能与诱导巨噬细胞产生自噬有关。

Jagannath等[4]也发现,用野生型结核分支杆菌减毒菌株或卡介苗(BCG)干预的小鼠,在雷帕霉素诱导的自噬作用下,抗原呈递细胞表达抗原Ag85B明显增强,雷帕霉素还使得结核分支杆菌局限在感染细胞的自噬小体和溶酶体中。

1.2 与自体吞噬有关的基因

与自体吞噬有关的分子最早是在S.cerevisiae和其他一些真菌中发现的,这些发现为自体吞噬的研究奠定了理论基础。目前大约有 30多种基因和自体吞噬有关,这些基因被称为自体吞噬有关基因(ATG)。其中有 15种基因是与真核细胞中小囊泡的双层膜形成有关。这些基因编码的蛋白会按照某种方式暂时排列,并聚集在吞噬小体中,然后会参与吞噬的进一步形成。对于这些蛋白的特殊功能和其与自体吞噬的关系还不是很清楚。在此只对 15种ATG中的一些已知功能的几种基因做一些介绍。

Cheong＆Klionsky等通过诱导自体吞噬的方法在酵母的自体吞噬体中首先发现了 Atg1-Atg13-Atg17。Atg1-Atg13-Atg17符合物会影响一些蛋白,而这些蛋白是选择型与非选择型自体吞噬均无法缺少的,因此人们提出假设,这些重要的蛋白控制着这两种自体吞噬的转换。在哺乳动物的细胞中同样存在着这样的复合物。Atg9是自体吞噬形成保守机制中的唯一一种跨膜蛋白,这种蛋白也会在自体吞噬体周围募集。与其他相类似的蛋白不同,Atg9会往返穿梭于自体吞噬体与其他一些不是很重要的细胞器之间,这些细胞器与线粒体非常接近。在酵母自体吞噬体中Atg1-Atg13-Atg17,Atg18和Atg2参与了 Atg9的逆向转运。

2 自体吞噬体

微生物通过内吞作用进入到吞噬小体后,吞噬小体内的物质发生一系列的变化,首先形成初级内体,然后是吞噬溶酶体的形成。在这个过程中,机体会产生一些抗菌性质的分子,如有毒性的活性氧,抗菌肽,蛋白水解酶,巯基还原酶,质子泵等。活性氧物质由烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的氧化作用产生[9]。当机体有炎症信号时,在 NADPH氧化酶 2(NOX 2)的作用下吞噬细胞会在吞噬溶酶体内产生活性氧。吞噬小体产生防御素类的抗菌肽。酸性条件下的吞噬小体会使组织蛋白酶类的阮酶激活,进而增加了吞噬小体杀死微生物和对抗原的处理能力。总之,吞噬溶酶体形成的物质可以增加机体抗微生物和抗原处理的功能。

吞噬小体能分解蛋白,处理抗原时,肽类物质必须避免被完全分解,从而才能被 MHC分子呈递,这点通过调节不同抗原呈递细胞在激活或成熟的不同阶段蛋白水解和吞噬小体的酸性来实现[10～12]。那么吞噬小体是如何调节的?之前有研究表明,增加溶酶体蛋白酶的表达可激活巨噬细胞。但最新使用一些技术或者蛋白质组学分析的有关巨噬细胞的研究表明,干扰素γ和脂多糖可以增加巨噬细胞的活性。干扰素γ和脂多糖是通过能降低囊泡的蛋白水解活性,从而避免肽的完全水解,同时为抗原呈递提供了最佳肽片段,进而激活巨噬细胞[13]。吞噬小体的酸性化在树突细胞中比巨噬细胞中缓和,这也许就是树突细胞中MHC-Ⅰ分子处理效率高的原因,这点对于抗原呈递细胞将抗原呈递给幼稚型 T细胞是非常有意义的[14]。树突细胞通过Rab27a影响 NOX2含量,从而使树突细胞的酸性比较缓和。这点可以明显降低抗原分解能力,使得成为最佳片段,从而被抗原呈递细胞呈递,而不会被彻底分解[15]。这就再次说明NOX2会影响吞噬小体的抗微生物和抗原呈递功能。

3 吞噬小体 MHC-Ⅱ类抗原处理

吞噬小体在MHC-Ⅱ类抗原处理过程中起重要作用。有实验报道,结核杆菌和特异性抗原包被在磁珠表面构建抗原类物质,巨噬细胞的吞噬小体会通过内吞作用吞噬这种抗原类物质,同时阮酶类对其进行分解,在吞噬小体内产生与MHC-Ⅱ有关的肽片段[16～18]。在结核感染的树突细胞中,MHC-Ⅱ和 CD 1b分子在吞噬小体周围募集[19],但一段时间之后,树突细胞的快速成熟导致其对MHC-Ⅱ抗原的处理能力有所下降,而CD1b分子仍能有效的呈递脂质抗原。MHC-Ⅱ处理抗原的能力的下降是由于在抗原有效之前,MHC-Ⅱ分子快速从吞噬小体转到细胞质膜。在沙门氏菌诱导的囊状小泡中,MHC-Ⅱ分子和 HLA-DM没有相互作用,同时MHC-Ⅱ分子也没有和抗原结合,这样沙门氏菌就逃离了 CD 4+T细胞的免疫反应。

影响吞噬小体成熟的有机物会影响MHC-Ⅱ抗原的处理和呈递吗?结核通过能抑制吞噬小体的成熟从而能寄生在吞噬细胞里;这种机制同样能通过降低肽片段的酶水解过程,从而降低 MHC-Ⅱ分子呈递的抗原,这可帮助微生物逃离CD4+T细胞的免疫反应。体外用不能逃离溶酶体转运的BCG感染的鼠巨噬细胞和树突细胞后,其抗原呈递能力和野生株的抗原呈递能力相似[20～21]。此外,体外有关小鼠模型中各种结核突变株和野生株抗原诱导 CD 4+Th1反应和CD8+CTL反应的实验显示,突变株和野生株的这两种能力均相似[22]。尽管以前人们认为死结核杆菌没有能力抑制吞噬小体的成熟,但是现有研究表明,结核杆菌的活菌和死菌在抗原处理和将抗原呈递给由 MHC-Ⅱ分子限制的 T细胞。这就说明,在结核杆菌侵入机体后,吞噬小体的成熟不会影响抗原的处理和呈递[23]。然而,也有研究表明,H 37Rv和 BCG均会干扰吞噬小体的成熟,且抗原呈递能力比H 37Ra低,而 H 37Rv和 BCG抑制吞噬小体成熟的能力低,这就表明吞噬小体的成熟和抗原呈递能力相一致[24]。此外,与H 37Rv野生株和BCG相比,抑制吞噬小体成熟能力降低的H 37Rv突变株的诱导 CD 4+T细胞反应能力增强。分泌组织蛋白酶S的BCG比野生株能更有效的处理抗原,这和其能促进吞噬溶酶体的功能有关[25]。为研究吞噬小体的成熟是否和抗原呈递能力有关,需用结核的不同菌株做更多的研究。

4 TLR信号传导和细胞自噬对吞噬小体成熟及其处理抗原的调节

关于 TLR信号传导是否对吞噬小体成熟及其处理抗原的能力起调节作用还存在着争议。Blander和 Medzhitov发现,由侵入机体的微生物激活的巨噬细胞TLR可以同时调节巨噬细胞的吞噬作用和巨噬细胞内吞噬小体的成熟,而在凋亡细胞中不可以[26]。由微生物诱导的模型中,TLRs可以调控吞噬小体成熟,但在凋亡细胞模型中则不可以。接着他们证实,在树突细胞中,当凋亡细胞和颗粒性抗原伴随有TLR配体时,能被 MHC-Ⅱ更有效的呈递,这就显示机体存在一种调节机制能阻止机体免疫系统的自我识别[27～29]。相反,Russell和 coworkers证实,TLR 2 or TLR 4的激动剂不会影响吞噬小体的成熟。

细胞自噬是机体一种重要的防御和保护机制。细胞可以通过自噬和溶酶体,消除、降解和消化受损、变性、衰老和失去功能的细胞、细胞器和变性蛋白质与核酸等生物大分子。为细胞的重建、再生和修复提供必须原料,实现细胞的再循环(Recycling)和再利用。它既是体内的“垃圾处理厂”,也是“废品回收站”;它既可以抵御病原体的入侵,又可保卫细胞免受细胞内毒物的损伤。在机体的免疫、感染、炎症、肿瘤、心血管病、神经退行性病的发病中具有十分重要的作用。CMBI曾在 308期作过特别报道。近年来在自噬的发生机理研究中,又有了新的进展。

溶酶体会和自噬泡融合,溶酶体内的物质会降解。与自噬有关的蛋白在吞噬小体蛋白质组学中已做了相关研究[30]。带有TLR2激动剂的吞噬磁珠使得自体吞噬体标志蛋白 LC3能被迅速募集到吞噬小体周围[31]。通过MyD 88/Trif信号通路,吞噬小体募集LC3到其周围,标志物是LPS[32]。其他 TLRs如 TLR 7,它们的激动剂能诱导自体吞噬,并且使寄生在吞噬小体内的微生物幸存率下降[33]。自吞作用可以杀死细胞内的微生物,否则这些细胞内的微生物可以逃离机体的杀伤机制[34]。有大量的研究表明,自噬作用在 MHC-Ⅱ呈递内源性抗原这一过程中有重要的作用[35]。最近有报道证实,APCs的自体吞噬有助于 MHC-Ⅱ类肽的呈递[36]。

5 总 结

吞噬小体的组成和功能在不同的细胞中表现是不一样的,对吞噬性APCs的抗原处理功能有直接的影响。和树突细胞相比,巨噬细胞有更强的杀死微生物的能力,并且巨噬细胞的吞噬小体酸性更强,有更高的蛋白水解能力。所以,巨噬细胞能很好的杀死微生物和呈递MHC-Ⅱ类抗原,但对MHC-Ⅰ类抗原呈递则无优势。

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(责任编辑:朱宝昌)