治疗细菌性疾病的有力武器——噬菌体及其裂解酶

顾敬敏,韩文瑜,路 荣,雷连成,杨勇军,冯 新,孙长江,杜崇涛

(吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春,130062)

随着对抗生素大量的使用和无节制的滥用,人们逐渐发现了对各种抗生素不敏感的菌株。20世纪 40年代,首次分离到对青霉素有抗性的耐药菌株,到 60年代,耐药性菌株已经普遍存在[1,2]。像粪肠球菌、不动杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌等病原菌对大多数的抗生素都具有很强的耐药性。尤其是对革兰氏阴性菌(如,不动杆菌)来说,已经可以宣布走到了抗生素时代的尽头[3]。

早在 1917年,噬菌体就已经被发现,并且之后受到了人们的关注。但由于当时的技术水平有限,对噬菌体的认识不透彻,因此没有发展起来,后来渐渐被人们遗忘。20世纪 90年代末,鉴于愈来愈严重的细菌耐药问题,各国研究人员又开始重新探索利用噬菌体治疗致病性细菌感染的可行性问题。近几年,噬菌体重新得到了各国研究人员的广泛关注。随着科学的发展,人们对噬菌体的研究逐渐深入,噬菌体及其裂解酶的应用正在逐步走向成熟。

1 噬菌体及其裂解酶概述

1.1 噬菌体

噬菌体(Bacteriophage,简称phage)又叫细菌病毒,是一种可以侵入细菌细胞内,通过酶的作用破坏细胞壁,使细菌裂解从而将其杀灭的病毒。噬菌体分为烈性噬菌体和温和性噬菌体,前者可在敏感宿主菌内增殖并使之裂解,亦称为毒性噬菌体(virulent phage)[4]。

噬菌体对细菌的破坏分两步进行[5]:(1)吸附识别;(2)裂解。

1.2 裂解酶

噬菌体裂解酶(Lysin或Endolysin)是双链 DNA噬菌体所特有的、在病毒复制晚期合成的一类胞壁质水解酶。多数噬菌体具有编码 3种细胞壁水解酶的基因,分别为裂解酶、酰胺酶和内肽酶[6],其中酰胺酶是国内外研究比较多的一种裂解酶。裂解酶的高亲和性与种属特异性的细胞壁糖基有关,而后者常常是细菌存活的必要成分。因此,细菌很难产生对裂解酶的抗性[7]。

2 利用噬菌体对细菌感染进行治疗

2.1 噬菌体对细菌性疾病治疗的可行性

近期,有很多应用噬菌体对细菌感染进行治疗的报道,充分证明了噬菌体治疗的可行性。

波兰的 Miedzybrodzki等[8]对经过噬菌体治疗的伴随细菌感染的炎症反应的病人进行了回顾性分析,分析结果表明,在经过噬菌体制剂治疗后,病人体内的C反应蛋白(CRP)血清浓度、白细胞计数(WBC)都有明显的降低,而红细胞沉淀系数(ESR)没有太大的改变。验证了利用噬菌体制剂对病人实施治疗后,确有消除由细菌感染引起的炎症反应的特性。Denou等[9]检测了用T4噬菌体对大肠杆菌引起的腹泻进行了治疗后噬菌体在各器官的含量,结果显示,噬菌体在盲肠、结肠的滴度较高,而在小肠的滴度就很低,在血液、肝脏和脾脏没有检测到。治疗 1个月后没有发生副反应,也没有发现抗 T4噬菌体的抗体形成。由以上实例可知,利用噬菌体治疗没有给动物和人造成副反应,噬菌体将可成为一种重要的候选治疗制剂。

Nakai等[10]研究了在水产养殖中应用噬菌体防治病原菌感染水生生物的可行性。结果表明,特定病原菌感染鱼群时,在附近总能分离出烈性噬菌体;当病原菌感染鱼体内部时,噬菌体也会在体内找到,并能长期存在;无论是实验条件下还是自然条件下,在鱼体内都不易产生噬菌体的抗体。

2.2 应用纯化噬菌体治疗细菌感染

噬菌体可以特异性的杀灭病原菌,而不影响正常菌群的存在。Wang等[11]腹腔注射纯化的噬菌体,以治疗被耐 β-内酰胺类抗生素绿脓杆菌感染的小鼠,收到了良好的效果。Capparelli等[12]对感染金葡菌(包括 MRSA)的小鼠进行了噬菌体的治疗。结果表明,噬菌体在体内和体外都可以杀灭受感染巨噬细胞内部的金葡菌。Biswas等[13]对一株临床分离到的耐万古霉素的粪肠球菌引起的小鼠菌血症进行了噬菌体治疗。研究表明,感染 45m in后用噬菌体进行治疗,治愈率可达 100%,即使小鼠处于频死状态时再用噬菌体进行治疗,治愈率也可达 50%。Chibani-Chennoufi[14]与Vinodkumar[15]也分别利用经过纯化的噬菌体对大肠杆菌感染和患多重耐药的绿脓杆菌性败血症的小鼠进行了治疗,效果非常好,远胜过抗生素的治疗。

除了以上用途,另外还可以将纯化的噬菌体用于食品加工过程中,以防止细菌对食品的污染。García等[16]将烈性噬菌体应用到凝乳的加工过程中,对金黄色葡萄球菌进行生物控制,为乳制品加工厂解决了金葡菌污染的问题。

2.3 应用半衰期较长的噬菌体治疗细菌感染

1996年Merril等[17]通过将噬菌体在小鼠体内连续的传代培养,筛选出了能在机体内有较长半衰期的噬菌体变异株。其中筛选到了具有长期循环特性的大肠杆菌λ噬菌体和鼠伤寒沙门氏菌 P22噬菌体。到 2005年,Vitiello等[18]又对分离出的具有长期循环特性的大肠杆菌λ噬菌体进行了进一步的研究。经比较发现传代后的噬菌体上E蛋白的一个氨基酸发生了替换。正是因为这一小小的变化使它在动物机体内存在的时间延长了 1 000倍以上。

2.4 应用广谱噬菌体治疗细菌感染

一般外伤感染是由几个同种不同型的病原菌,甚至不同病原菌混合感染引起的,所以广谱噬菌体治疗具有更高的可行性。Wu等[19]以肺炎克雷伯菌为宿主菌在医院样品中分离到 1株噬菌体,命名为Kpp95,遗传物质为双股DNA,与T4噬菌体形态相似,它具有很宽的噬菌谱,除肺炎克雷伯菌(对 107株肺炎克雷伯菌中的 65株有裂解作用)外,还能裂解催产克雷白(氏)杆菌、聚团肠杆菌、粘质沙雷菌。这种宽谱噬菌体在感染性疾病的治疗上具有很大的潜力。

Josephsen等[20]对 11年前后在干酪车间乳清中分离出的噬菌体进行了比较,发现“新”噬菌体比“老”噬菌体的裂解能力和裂解谱都增强了很多,致使发酵无法进行。Scholl等[21]的研究发现由于噬菌体 K1-5能编码 2种尾丝蛋白,所以可以识别并裂解 2种大肠杆菌(K1和 K5)。这为人工改造噬菌体、增强其裂解谱提供了新的思路。

2.5 应用混合噬菌体治疗细菌感染

对不同菌株的噬菌体混在一起,制成“鸡尾酒”,“拓宽”噬菌体的裂解谱,可以弥补特异性太强的缺点,使噬菌体治疗的应用性加强。Niu等[22]对临床上感染大肠STECO 157:H 7的牛和人进行了鸡尾酒噬菌体的治疗。结果表明,混合噬菌体的治疗效果明显优于单独使用纯的噬菌体(即使纯噬菌体的裂解力强于混合噬菌体中的每一种噬菌体)。Denou等[9]的研究也表明混合噬菌体在很多时候优于纯的噬菌体制剂。他对利用 T4噬菌体治疗由大肠引起的小鼠腹泻的潜力和可能存在的问题作了研究。T4噬菌体不但具有属特异性,甚至有型特异性,单独使用一种纯的噬菌体效果不佳,因此利用该类噬菌体治疗大肠引起的腹泻时必须将几种噬菌体混到一起,形成噬菌体“鸡尾酒”,才能更有效的对腹泻进行治疗。Tanji等[23]也利用噬菌体“鸡尾酒”对由大肠杆菌O 157:H 7引起胃肠感染的小鼠进行了治疗。

Merabishvili等[24]的研究团队研制出了治疗烧伤后由绿脓杆菌和金葡菌引感染的噬菌体“鸡尾酒”制剂。他们通过对该制剂进行最适 pH、致热原的有无、无菌检验、透射电镜观察、温和噬菌体的剔除、噬菌体基因组的测序及原生代的分析、细胞毒性的有无、最适储存温度以及喷剂的稳定性等方面的检验,申请到了生产批号,并且应用到了烧伤医院的临床上。估计这样的噬菌体制剂在不久的将来会陆续的被生产出来。

3 对噬菌体裂解酶进行表达并应用于细菌感染的治疗

到目前为止,人们对裂解酶已经做了大量的研究。Raina[25]早在 1981年就对C群链球菌噬菌体的裂解酶进行了分离纯化,并对其生物学特性进行了测定。Yokoi等[26]对瓦氏葡萄球菌前噬菌体的裂解系统(穿孔素-裂解酶)做了一些研究,将表达穿孔素和裂解酶的基因进行了原核表达及突变分析,并对表达产物的结构进行了分析。Obeso等[27]对金黄色葡萄球菌噬菌体 ΦH 5的裂解酶进行了原核表达,将基因 lysH 5克隆到大肠杆菌内,表达产物为 LysH 5。该蛋白具有 3个结构:CHAP(具有作用于半胱氨酸、组氨酸的天门冬酰胺酶/肽酶)、amidase(酰胺酶)、SH 3b(细胞壁识别结构)。并且将纯化后的该蛋白用于牛奶中金黄色葡萄球菌的抑制,效果非常明显,在 37℃作用 4 h后,就完全检测不到该菌。这在当时是首次将噬菌体裂解酶应用于实际生产当中。

Delisle等[28]对内氏放线菌噬菌体Av-1的裂解酶基因进行了分离、克隆,并在大肠杆菌细胞内进行了表达。Gaeng等[29]将李斯特菌噬菌体的裂解酶基因导入到乳酸乳球菌中进行了表达。O'Flaherty[30]等对一金黄色葡萄球菌噬菌体的裂解酶也在乳酸乳球菌胞内进行了表达,并测得表达产物对多个型的金葡菌均具有裂解作用,其中包括MRSA。表明发酵产生的裂解酶在由金葡菌引起感染的治疗中有很重要的应用价值。Celia等[31]对 1株乳房链球菌温和噬菌体的裂解酶进行了研究,结果表明,该酶对多个型的链球菌都有裂解作用,提示该酶在链球菌引起的乳房炎的治疗中有巨大的潜力。

4 噬菌体及其裂解酶的基因工程改造

现在,基因技术逐步走向成熟,可以利用基因工程的技术去解决上面提到的纯噬菌体裂解谱窄、不具有较长的半衰期、裂解活性低等问题。可以根据具体的需要,用基因工程的方法改造噬菌体。2007年,Garcia[16]等首先在乳中分离出温和性噬菌体,经过随机缺失,使之转化为烈性噬菌体。然后将噬菌体用于乳制品加工过程中金葡菌的控制,收到了良好的效果。Yoichi等[32]针对不同型大肠杆菌的噬菌体进行了同源重组,结果表明,原来对一非宿主菌没有裂解作用的噬菌体,当其与这一非宿主菌噬菌体的尾丝发生了重组后,就具有了裂解这一非宿主菌的能力,同时失去了裂解原宿主菌的能力。

Westwater等[33]认为可以把表达杀菌蛋白的基因(程序性死亡中的毒素基因)整合到温和噬菌体上,然后将温和噬菌体作为一种载体,定向的结合到宿主菌上并进行整合,然后释放表达的杀菌蛋白,类似于生物导弹,定向的将目的菌株杀灭。Westwater团队用实验验证了这一理论的可行性。

Cheng等[34]对引起新生幼儿脑膜炎的链球菌噬菌体的裂解酶进行了人工诱变,在变异基因表达出来的酶当中,有些酶在裂解谱没有变的情况下,杀菌活性增强了 18～28倍。Briers等[35]对绿脓杆菌噬菌体ΦKZ的裂解酶KZ144的高亲和力区域进行了研究。该区域是由几个模块儿嵌合组装起来的。通过改造这个裂解酶的结合结构,从而增强绿脓杆菌噬菌体编码的裂解酶的特异性亲和力。

5 噬菌体与抗生素的结合使用

Lu等[36]对噬菌体进行了改造,然后用其与抗生素一起使用,以期能减少细菌对抗生素耐药性的产生。经过改造的噬菌体的表达产物可以攻击细菌的网络结构,这些都是抗生素不能直接作用的方面,形成了互补。KOHANSKI等[37]的研究表明,抗生素是通过阻止羟基形成,进而造成DNA、蛋白质、脂类的损伤,最终使细菌死亡。但 DNA的损伤会引发细胞的 SOS反应,自动对损伤的 DNA进行修复,从而减少致死性的损伤[38,39]。如果能够敲除recA、抑制SOS反应,就可以大大增强抗生素的杀菌能力。以前曾经报道过lexA的表达能够抑制 SOS反应,从而能避免耐药性的产生[40]。M13是非烈性的丝状噬菌体,它不裂解细菌,而是将自身的基因整合到宿主菌的DNA上。Little等[41]对丝状噬菌体 M13进行了改造,使其携带lexA3基因,它的表达产物是SOS反应的抑制剂。因此,经过改造的噬菌体可以作为抗生素治疗细菌感染的佐剂。

6 展 望

耐万古霉素肠球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌以及多耐药结核杆菌等耐药菌的出现,使得噬菌体与裂解酶治疗再度引起人们的关注。目前人们的研究兴趣主要集中在应用基因工程技术改造噬菌体及其裂解酶的方面。并且人工改造噬菌体的理论和技术已趋成熟,噬菌体治疗也取得了突破性的进展,显示出了潜在的巨大应用前景。广谱、高效、在机体内具有长期循环特性的噬菌体也同样可以通过人工改造获得。和抗生素治疗一样,噬菌体治疗也存在着细菌对噬菌体的耐受问题,对其耐受机制的揭晓还有待进一步研究。但正如抗生素的使用存在耐药性的问题并不排斥人类对抗生素的开发应用一样,耐受性的问题同样不排斥噬菌体治疗临床应用的可能性。相信随着研究的不断深入,噬菌体与其裂解酶应用于临床指日可待,噬菌体的时代即将到来。

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(责任编辑:石瑞珍)