嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统研究进展

王 娜,张小军,刘永杰,陆承平

(南京农业大学动物医学院,江苏南京,210095)

嗜水气单胞菌(Aeromonas hyd rophila),作为气单胞菌的模式种,隶属于气单胞菌科(Aermonadaceae)气单胞菌属(Aeromonas),为嗜温、有动力的气单胞菌群[1]。该菌普遍存在于淡水、污水、淤泥、土壤和人类粪便中,对水产动物、畜禽和人类均有致病性,可导致鱼类的爆发性败血症,已给我国渔业生产带来相当大的经济损失。人类感染该菌可引起胃肠炎、腹膜炎、败血症等[1,2],是一种典型的人—兽—鱼共患病病原,其致病作用已成为当今公共卫生关注的问题。

现普遍认为嗜水气单胞菌的致病性与其产生的毒力因子密切相关。已知的致病因子主要有外毒素(气溶素、溶血素和细胞毒性肠毒素等)、胞外蛋白酶(丝氨酸蛋白酶、核酶和淀粉酶等)、结构蛋白(转铁蛋白、S层蛋白、外膜蛋白和菌毛等)和信号相关蛋白(如分泌系统蛋白等)。细菌分泌系统的发现是近年来细菌致病机制研究的重要进展。致病菌为了在宿主体内生存、繁殖和扩散,必须分泌一些蛋白性质的毒力因子;而一些非致病菌为了适应其生活环境,也向外分泌一些蛋白质。革兰阴性菌有许多分泌蛋白和外露蛋白,虽然细菌分泌的这些蛋白功能各异,但系统发育和遗传进化分析表明,细菌是通过相对较少的几种分泌机制将这些蛋白分泌出去的。到目前为止,共发现 6种类型的分泌系统,它们以各自特有的方式参与细菌的致病过程。其中的Ⅲ型分泌系统(typeⅢ secretion system,TTSS)与动植物革兰阴性病原菌的毒力因子分泌有关,因此备受关注。

1 嗜水气单胞菌 TTSS的发现

Ⅲ型分泌系统是一个由多种蛋白分子的复合体所构成的跨膜蛋白输出装置,存在于动植物许多革兰阴性病原菌中。在病原菌与宿主细胞接触后,这一系统得以启动,具有接触介导的特征。启动后细菌分泌与毒力有关的多种蛋白质,与相应的伴侣蛋白结合,从细菌的胞浆直接进入宿主细胞胞浆,发挥毒性作用[3]。已确定具有Ⅲ型分泌系统的细菌有沙门菌(Salmonella)、志贺菌(Shigella)、耶尔森菌(Yersinia)、大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等。

Yu等[4]首次报道了嗜水气单胞菌 AH-1株中存在 TTSS,利用基因步移法克隆了全长的 TTSS序列,其中包括 5个启动子,25个开放阅读框表达 25种TTSS组分蛋白。AH-1株的TTSS定位在基因组中,而此前报道同属的杀鲑气单胞菌TTSS位于质粒上。插入失活其中两个组分基因 aopB和aopD,结果发现细菌毒力显著降低,说明TTSS与嗜水气单胞菌致病性密切相关。随后运用 1对保守引物检测 TTSS在嗜水气单胞菌不同分离株中的分布,结果 33株待检菌株中均能扩出条带,测序发现这 33条序列同源性很高,说明 TTSS广泛存在于嗜水气单胞菌菌株中。同时,在嗜水气单胞菌PPD 134/91中发现TTSS基因岛,并证实 TTSS为嗜水气单胞菌致病机制中主要毒力因子之一[5]。

Vilches等[6]发现,TTSS广泛分布于气单胞菌属不同种如嗜水气单胞菌、维隆气单胞菌和豚鼠气单胞菌临床和环境分离株中,并且发现TTSS基因ascV缺失株较野生株的毒性和毒力均减弱。Sha等[7]根据耶尔森菌 TTSS组分基因yscV设计探针,在嗜水气单胞菌人源腹泻分离株 SSU基因组文库中找出 26 855 bp全长的 TTSS,包含 35个基因编码区,比AH-1株多 10个基因。构建aopB基因缺失株以及细胞毒性肠毒素 act基因缺失株发现细胞毒性减弱,这两个基因的双缺失株则是无毒力的。这再次证明TTSS跟细菌毒力有关。AH-1与SSU的 TTSS序列比较发现,两株菌的 TTSS同源性并不高。例如,TTSS跨膜定位装置 aopB,aopD的基因同源性分别只有 50%,53%。虽然 SSU株与 AH-3株 TTSS都含有 35个基因,但每个基因核苷酸水平的同源性从 28%到89%不等,氨基酸水平的同源性在 38%到97%之间。序列变异导致的蛋白构象变化可能会影响TTSS向宿主注射效应蛋白。这也解释了虽然包括无毒株在内的许多嗜水气单胞菌都含有TTSS,但它们的结构并不完全一样,这也许决定了它们毒力方面的差异。目前为止,已有AH-1,AH-3,SSU等3株细菌公布了 TTSS全长序列,并且检测发现许多株嗜水气单胞菌均含有 TTSS,但全基因组测序嗜水气单胞菌ATCC 7966并没有发现任何 TTSS同源序列[8]。有几点推测:同属的杀鲑气单胞菌 TTSS位于质粒上,ATCC 7966的TTSS可能整合于被丢失的质粒中;ATCC 7966全基因组序列中发现与霍乱弧菌毒力分泌相关的Ⅵ型分泌系统同源的序列,TTSS的功能可能由新发现的Ⅵ型分泌系统代替;TTSS的功能由鞭毛分泌装置代替,这在耶尔森菌中已有报道[8]。

2 TTSS效应蛋白

Ⅲ型分泌系统受到接触诱导后,分泌与毒力有关的多种蛋白质注入宿主细胞内,这些蛋白称为效应蛋白。效应蛋白借助于Ⅲ型分泌系统分泌器形成的通道,在分子伴侣的帮助下,直接从细胞质分泌到细胞外[3]。分泌过程受调节蛋白的调节。若细菌接触上皮细胞,可将一些分泌蛋白注入宿主细胞中[3]。这些分泌的效应蛋白抑制宿主的抗细菌免疫应答机制,或者改变宿主的细胞结构以利于细菌复制并诱导发病。

人们所知的对动物致病的效应蛋白约 20余种[9～11]。其中 6种由耶尔森菌属分泌,包括:YopE,YopH,YopM,YopJ/P,YopO/YopA,YopT;沙门菌属 SPI-1编码装置分泌有 8种:AvrA,SipA,SipC,SopB,SopD,SopE,SotP,SspH 1;SPI-2系统分泌的有 4种:ExoS,ExoT,ExoV,ExoY;志贺菌属分泌有 2种:IpaA,IpaC。

目前为止,嗜水气单胞菌同属的杀鲑气单胞菌发现了 4个效应蛋白(AexT,AopP,AopH,AopO);嗜水气单胞菌发现了 2个效应蛋白(AexT,AexU)。Vilches等[12]发现嗜水气单胞菌AH-3中 ADP-核糖基化毒素(AexT)通过Ⅲ型分泌系统迁移。缺失aexT或 TTSS基因都不能在上清中检测到AexT存在,aexT缺失株毒力轻微下降,TTSS基因缺失株毒力显著下降。AexT是在嗜水气单胞菌中发现的第一个效应蛋白,也是迄今为止在嗜温气单胞菌中发现的最小的效应蛋白,它的发现证明了 TTSS作为功能结构在毒力因子分泌过程中发挥作用。另一个AexT类似的效应蛋白AexU发现于嗜水气单胞菌 SSU株中[13],它也具有 ADP-糖化转移酶的活性,与铜绿假单胞菌双功能毒素 ExoT/S同源,杀鲑气单胞菌中的AexT蛋白也有相同的功能。TTSS系统内膜复合物ascV基因缺失后AexU转运受阻,表明AexU的分泌也是TTSS依赖型的。铜绿假单胞菌的双功能毒素ExoT/S的功能已经了解,它的N端残基催化 rho依赖的肌动蛋白解聚,导致细胞形态改变和可逆的细胞毒性,它的C端为ADP-核糖化转移酶活性亚基,具有很强的细胞毒性,导致真核细胞不可逆的损伤。AexU蛋白N端残基(231aa)与杀鲑气单胞菌AexT蛋白N端残基有 67%的同源性,C端残基在NCBI数据库中没有发现同源蛋白,但全长的蛋白仍然具有ADP-核糖化转移酶的活性。体外表达 AexU的全长蛋白、N端亚基、C端亚基,它们都表现出 ADP-核糖化转移酶活性,但前 2种蛋白活性明显高于后者。Hela细胞表达这 3种蛋白后发现肌动蛋白重组、细胞变圆、染色质浓缩,这表明 AexU在嗜水气单胞菌感染的致病性中发挥重要作用[13,14]。Sierra[15]证实,嗜水气单胞菌SSU株 AexU作为 ADP-核糖化转移酶和 GTP酶活化蛋白,参与宿主细胞的凋亡和肌动蛋白的分解,AexU可以阻止c-Jun,JNK和IkB的磷酸化并抑制 HeLa细胞 IL-6和 IL-8的分泌,从而抑制 NF-kB和阻断 Rho GTP酶的活性。aexU基因的缺失使其失去 ADP-核糖化转移酶和GTP酶活化蛋白活性,从小鼠的死亡率和并发的促炎症反应情况来看,AexU具有ADP-核糖化转移酶和GTP酶活化蛋白调控其他未知活性作用。

另外,Yu等[16]研究嗜水气单胞菌AH-1胞外蛋白发现,新的蛋白包括类似 ExoT蛋白显示经嗜水气单胞菌TTSS途径分泌,同时发现嗜水气单胞菌侧生鞭毛和TTSS的相互作用。

3 嗜水气单胞菌 TTSS对其毒力的致病性调控

众所周知,TTSS在病原与宿主的相互作用中发挥了重要作用。Fadl等[17,18]通过构建嗜水气单胞菌SSU株 act/aopB缺失株,通过感染小鼠,利用基因芯片等技术证实宿主感染过程转录水平的变化。Vilches[19]通过分析 AH-3 TTSS调节元件aopN-aopD和效应蛋白AexT启动子,构建axsA和aopN突变株,证实其作为TTSS主要转录调节基因的功能。同时,TTSS的表达与其他不同毒力因子(如脂多糖、PhoPQ双组分系统、ahyIR密度感应系统等)之间存在复杂的相互作用。这是关于嗜水气单胞菌 TTSS调控网络的首次报道。Carvalho-Castro等[20]利用PCR技术检测嗜水气单胞菌分离株中 TTSS相关基因ascV和aopB。结果表明,ascV+/aopB+在死亡率高的发病鱼体内分布率高,从而揭示TTSS的存在很可能增加嗜水气单胞菌的毒力,并可用于嗜水气单胞菌分离株的毒力分型。

4 其它分泌系统

除了Ⅲ型分泌系统,革兰氏阴性菌尚有Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅳ型、Ⅴ型和 6型分泌系统。Ⅰ型可将细菌分泌物蛋白质直接从胞浆送达细胞表面,Ⅱ型则是细菌将蛋白质分泌到周质间隙,经切割加工,然后通过微孔蛋白穿越外膜分泌到胞外。Ⅳ型是一种自主运输系统,其分泌的蛋白质需切割加工,而后形成一个孔道使自身穿过外膜 。

嗜水气单胞菌中已有报道的功能分泌系统,除了Ⅲ型之外只有Ⅱ型和Ⅵ型分泌系统。Ⅱ型分泌系统由exeC-N和exeAB编码,ExeA和ExeB贯穿内膜形成复合物。ExeA包含ATP接合位点,其 N端具有ATP酶活性,ExeA-ExeB复合物为Ⅱ型分泌系统组装提供能量并且使ExeD分泌素多聚化。嗜水气单胞菌中,Ⅱ型分泌系统在气溶素(Aer)、细胞毒性肠毒素(Act)、蛋白酶、淀粉酶分泌过程中发挥作用[21～23]。嗜水气单胞菌 ATCC 7966全基因组测序发现 6型分泌系统(type 6 secretion system T6SS),该系统只在霍乱弧菌中有过报道[8]。Suarez等[24]从嗜水气单胞菌人源腹泻分离株 SSU中克隆出 6型分泌系统全长基因,研究发现 2个毒力分泌基因(virulence-associated secretion vas)vasH和 vasK对 T6SS基因表达非常重要,其中VasH是一种σ54依赖的转录调控子、vasK编码未知功能蛋白。vasH基因缺失阻止潜在的转移物溶血素协同调控蛋白(hemolysin coregulated protein Hcp)基因表达。vasK缺失能阻止Hcp分泌但不能阻止其向宿主细胞迁移。不管是动物试验还是细胞试验,均观察到这两种缺失株毒力下降。嗜水气单胞菌SSU野生株小鼠攻毒后能检测到 Hcp抗体,Hcp能和小鼠巨噬细胞接合,HeLa细胞表达 Hcp后引发细胞凋亡。随后发现,T6SS效应蛋白VgrG1,作为肌动蛋白 ADP-核糖转移酶活性能够通过半胱天冬酶 9的活性使细胞凋亡[25]。这些都足以说明 T6SS在嗜水气单胞菌感染致病性中扮演重要角色。

另外,ATCC 7966全基因组测序还发现了Ⅰ型分泌系统,它可能跟介导黏附的毒力因子跨膜转运有关[8]。

5 结 语

嗜水气单胞菌广泛存在,流行甚广,给渔业生产带来相当大的经济损失。尤其由嗜水气单胞菌引起的食物中毒、介水传染病、感染性腹泻、继发感染、败血症等频繁发生,其致病作用已成为当今公共卫生关注的问题,有必要从分子、细胞、乃至与真核生物相互作用的水平认识其致病机制。研究嗜水气单胞菌的分泌系统可深入揭示嗜水气单胞菌的分子机制。随着对各型分泌系统研究的深入,对嗜水气单胞菌的进化机制、致病性以及生物体的防御体系有了更深入的了解,并由此提供了许多有趣的问题和新的研究方向。尤其对于毒力因子分泌的研究将对解析致病蛋白的分泌调控途径,寻找阻断细菌致病蛋白分泌的作用靶标有重要意义。研究嗜水气单胞菌分泌系统效应蛋白的作用机制对于研发保护效果好、安全有效的疫苗具有一定的指导意义,同时也为嗜水气单胞菌病的预防和治疗提供新思路和新策略。

[1] JANDA J M.Aeromonas and Plesiomonas[C]//Sussman M.Molecular medical microbiology.San Diego,Calif:cademic Press,2001:1 237-1 270.

[2] SHA J,KOZLOVA E V,CHOPRA A K.Role of various enterotoxinsm in Aeromonas hydrophila-induced gastroenteritis:generation of enterotoxin gene-deficientmutants bymarker-exchangemutagenesis and evaluation of theirenterotoxic activity[J].Infect Immun,2002,70:1 924-1 935.

[3] CORNELISG R.The typeⅢsecretion injectisome[J].Nat Rev Microbio,2006,4(11):811-825.

[4] YU H B,RAO P S,LEE H C,et al.A typeⅢsecretion system is required for Aeromonas hydrophila AH-1 pathogenesis[J].In fect Immun,2004,72:1 248-1 256.

[5] YU H B,ZHANG Y L,LAU Y L,et al.Identification and characterization of putative virulence genes and gene clusters in Aeromonas hydrophila PPD134/91[J].Appl Environ Microbiol,2005,71:4 469-4 477.

[6] VILCHES S,URGELL C,MERINO S,etal.Com plete typeⅢsecretion system of amesophilic Aeromonas hyd rophila strain[J].Appl Environ Microbiol,2004,70:6 914-6 919.

[7] SHA J,PILLAI L,FADL A A.The typeⅢsecretion system and cytotoxic enterotoxin alter the viru lence of Aeromonas hydrophila[J].Infect Immun,2005,73:6 446-6 457.

[8] SESHADR R,JOSEPH SW,CHOPRA A K,et al.Genome sequence of Aeromonas hydrophila ATCC 7966T:jack of all trades[J].J Bacteriol,2006,188(23):8 272-8 282.

[9] GARMENDIA J,BEUZON CR,RUIZ-ALBERT J,etal.The roles of SsrA-SsrB and OmpR-EnvZ in the regulation of genes encoding the Salmonella typhimurium SPI-2 typeⅢsecretion system[J].Microbiology,2003,149(9):2 385-2 396.

[10] 邱茂锋,杨瑞馥.致病性耶尔森菌毒力因子YopM的研究进展[J].军事医学科学院院刊,2004,28(6):582-585.

[11] 王效义,杨瑞馥.沙门氏菌毒力岛及其Ⅲ型分泌系统[J].生物技术通讯,2004,15(2):160-161.

[12] VILCHES S,W ILHELMSM,YU H B.Aeromonas hyd rophila AH-3 AexT is an ADP-ribosylating toxin secreted through the typeⅢsecretion system[J].Microb Pathog,2008,44:1-12.

[13] SHA J,ANG S F,SUAREZG.Further characterization of a typeⅢsecretion system(T3SS)and of anew effector protein from a clinical isolate of Aeromonas hydrophila—PartⅠ [J].Microbial Pathogenesis,2007,43:127-146.

[14] SIERRA JC,SUAREZ G,SHA J,et al.Biological characterization of a new typeⅢsecretion system effector from a clinical isolate of Aeromonas hydrophila-partⅡ[J].Microb Pathog,2007,43:147-160.

[15] SIERRA JC,SUAREZ G,SHA J,et al.Unraveling themechanism of action of a new typeⅢsecretion system effector AexU from Aeromonas hyd rophila[J].Microb Pathog,2010,49:122-134.

[16] YU H B,KAUR R,LIM S,et al.Characterization of extracellular proteins produced by Aeromonas hydrophila AH-1[J].Proteomics,2007,7:436-449.

[17] FADL A A,GALINDO C L,SHA J,et al.Deletion of thegenes encoding the typeⅢsecretion system and cytotoxic enterotoxin alters host responses to Aeromonas hydrophila infection[J].Microb Pathog,2006,40:198-210.

[18] FADL A A,GALINDO C L,SHA J,et al.Global transcriptional responses ofwild-type Aeromonas hyd rophila and its virulence-deficientmutant in amurinemodelof infection[J].Microb Pathog,2007,42:193-203.

[19] VILCHES S,JIMENEZ N,TOMAS JM,etal.Aeromonas hydrophila AH-3 typeⅢsecretion system expression and regu latory network[J].App l Environ Microbiol,2009,75:6 382-6 392.

[20] CARVALHO-CASTRO G A,LOPESCO,LEALC A,et al.Detection of typeⅢsecretion system genes in Aeromonas hydrophila and their relationship with viru lence in Nile tilapia[J].VetMicrobiol,2010,144:371-376.

[21] HOWARD S P,GEBHARTC,LANGEN GR,et al.Interactions between peptidoglycan and the ExeAB complex during assembly of the typeⅡsecretin of Aeromonas hyd rophila[J].Molecular Microbiology,2005,59(3):1 062-1 072.

[22] SCHOENHOFEN IC,LIG,STROZEN T G,et al.Purification and characterization of the N-terminal domain of ExeA:a novel ATPase involved in the typeⅡsecretion pathway of Aeromonas hydrophila[J].JBacteriol,2005,187:6 370-6378.

[23] LIG,HOWATRD SP.ExeA binds to pep tidoglycan and forms amultimer for assemb ly of the typeⅡsecretion apparatus in Aeromonas hydrophila[J].Mol Microbiol,2010,76:772-781.

[24] SUAREZG,SIERRA JC,SHA J,etal.Molecular characterization of a functional typeⅥsecretion system from a clinical isolate of Aeromonas hydrophila[J].Microb Pathog,2008,44:344-361.

[25] SUAREZG,SIERRA JC,EROVA T E,et al.A typeⅥsecretion system effector protein,VgrG1,from Aeromonas hydrophila that induces host cell toxicity by ADP ribosylation of actin[J].JBacteriol,2010,192:155-168.

(责任编辑:朱宝昌)