人体外周血染色体G显带制备的影响因素

邱惠国 林晖 侯喜琴 赵军 宋秀宇

染色体G显带是研究细胞遗传学的基础，被广泛地用于基础医学、临床医学的研究和染色体病的确诊。整个制片过程繁琐，经历时间较长，任何一个步骤操作不当，均可影响染色体标本制备的最终效果。经过3500多份标本的制备，我们总结了一些经验。

1 染色体G显带玻片的制作

1.1 取血与接种时间 一次性真空采血肝素抗凝管(3 ml规格)，常规消毒肘部皮肤及抗凝管的进针处，抽取静脉血2～3 ml，轻轻摇匀，防止凝固，待接种培养。当天不能培养的标本应及时置于4℃冰箱存放以免影响细胞的活力，一般在采血后1～3 d内可进行培养。在4℃冰箱保存6 d的标本我们也曾培养，且染色体质量也不错。由于存放时间长，有活性的淋巴细胞少，此时应1000 r/min离心10 min后取白细胞层接种。

1.2 细胞培养基与接种全血量 人体血液中的淋巴细胞是一种分化细胞，它的细胞质很少，RNA和蛋白质的6合成速度也很慢，淋巴细胞几乎都是处在G0期或G1期，一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入植物血凝素(phytohemagglutinin PHA)时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，并开始进行有丝分裂，进入淋巴细胞生长周期。细胞经过68～76 h的培养，处于分裂期的细胞可达20%以上(我们曾做过此类的实验)，此时加入秋水仙素便可获得大量的中期分裂相细胞。培养基为培养的细胞提供营养，培养基成份中小牛血清和植物血凝素的含量，PH值情况，均可影响染色体分裂指数。我们使用杭州四季青胎牛血清15%，HYCLONE1640液体培养基85%，广州市医药工业研究所PHA 150 ug/ml，严格按无菌操作配制培养基。

接种前，将5 ml的培养液置室温融化。将超净工作台用紫外灯消毒30 min后，在超净台内用加样枪吸取410ul左右的外周血接种到每瓶培养基内、摇匀，淋巴细胞的接种密度应控制是在400～600个/ml。接种两瓶。置37℃恒温培养箱培养68～76 h;如果接种时发现外周血有小凝块，则捣碎凝块，加大接种血量如600ul，亦可获得成功。新生儿的标本由于血浆中含有较高的胆红素［1］及淋巴细胞含量高，应减少接种量如300ul，或者1000r/min离心10 min后取白细胞层150ul接种。

1.3 秋水仙素 秋水仙素在细胞培养分裂中所起作用是与微管形成或解聚密切相关的。秋水仙素一方面能阻滞微管(纺锤丝)形成，或使已形成的微管解聚;另一方面，秋水仙素的作用又能促使DNA的复制和有关蛋白质合成［2］。可见秋水仙素可抑制微管的合成使细胞处于分裂中期，又有生物毒性，影响细胞生长。因此，在血细胞培养时，秋水仙素加入的剂量及处理时间与中期分裂相的多少和染色体长短有密切的关系。在秋水仙素浓度对染色体有丝分裂阻断率的影响方面，陈德清教授等进行了大量的工作［3］。若秋水仙素浓度大，则处理时间短，如浓度小，则处理时间长。但若秋水仙素加入过量，或处理时间过长，染色体凝集和收缩变小，或发生异常分裂现象，甚至染色体破碎，不宜用于观察染色体的形态及计数;若秋水仙素加人太少，或处理时间偏短，染色体形态偏长或无中期分裂相，也不易进行染色体观察。故秋水仙素浓度及处理时间要准确把握。一般在血细胞培养68 h(即收获细胞前2 h)，用微量加样枪在各培养瓶内加入30～40 uL秋水仙素，使最终浓度为0.04～0.08 ug/ml，置37℃温箱继续培养2 h后收集细胞、制片，就能够收集到分裂相非常好的染色体。但有时因时间关系，我们在血细胞培养68至76 h内的各个时间点内，在各培养瓶内加入浓度30～40uL秋水仙素，使最终浓度为0.04～0.08 ug/ml，置37℃温箱继续培养2 h后收集细胞、制片，亦能够收集到分裂相非常好的染色体。甚至在终止培养前30 min加人150 uL秋水仙素使细胞生长停止在中期，也能收集到足够数量及分裂相好的染色体核型。

1.4 制片

1.4.1 收集细胞 从培养箱中取出培养瓶，用小吸管将培养物吹打均匀，移入10 ml刻度玻璃离心管内，以1000 r/min离心10 min，吸去上清液，保留底物。在吸去上清液时，要避免与上清液接触处的淋巴细胞层被吸弃，造成人为的大量中期分裂相细胞丢失。一般要求每次吸取上清液时都要在玻璃管的底部留上大约0.5 ml的上清液，以确保培养细胞不丢失。

1.4.2 低渗 低渗是制片好坏的关键环节。实验室一般多用37℃预温的0.075 mol/L的kcl低渗液，利用细胞内K+浓度远比细胞外K+浓度高这一特点，使淋巴细胞吸水膨胀和中期染色体分散铺展，而非红细胞解体，国内许多学者认为低渗使红细胞解体。为了达到淋巴细胞吸水膨胀但不自行破裂这一平衡点，低渗时间和低渗温度一定要掌握好。低渗时间不充分，染色体分散不好，呈团状;低渗过长，可引起细胞在滴片前破碎，染色体丢失，甚至由于染色体胀的太大而使之出现微毛和形态结构模糊不清，变得难以染色;低渗温度不够或预温温度不够可出现胞浆背景等现象，造成制片时分裂相不分散。所以，低渗处理适当，所得染色体轮廓清楚，可染色性强，在显带染色时能很好地显示带型特征。我们一般加入提前37℃预温的0.075 mol/L的kcl低渗液至8 ml刻度处，再用吸管快速吹打均匀，然后再置于37℃的水浴箱中，温育25 min，便可得到理想的效果。

1.4.3 固定 在染色体制片过程中需加入甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定液，主要目的是维持染色体的固有形态及细胞膜;抽提白细胞内的细胞质成份，从而有利于染色体分散;破坏红细胞。固定液可使细胞脱水，蛋白变性而使染色体变的粗大而适中。固定液需现配现用。低渗后的预固定很重要，固定液量不要多，一般是加入新配固定液1.5 ml进行预固定，加入固定液后用吸管轻轻吹打均匀，以后的每个步骤都要轻柔。在室温下静置5 min，然后离心1000 r/min、10 min，吸去上清液(同样注意不要将淋巴细胞层吸弃)，保留沉淀进行第一次固定;第一次固定时固定液沿管壁缓慢加入现配固定液，至管子8 ml刻度处，吹打均匀，离心1000 r/min、10 min，吸去上清液(同样注意不要将淋巴细胞层吸弃)，保留沉淀进行第二次固定;第二次固定类同第一次固定。调配最后滴片的悬液时，冰醋酸的含量可适当增加，这有助于染色体的散开，但冰醋酸的量不能太多，一般为甲醇∶冰醋酸(2∶1)。

1.4.4 滴片 滴片也是染色体制片好坏很关键的一步。载玻片的清洁度;滴片时操作不当致所滴悬液重叠;悬液浓度过浓或过稀;滴片时的高度等都直接影响染色体的分散。滴片时，先将新配制的固定液加入离心管，制成细胞悬液，加入量因制片多少及细胞的多少而定，以我们的经验以呈薄雾状为宜。滴片时需要有一定的高度，以使染色体分散良好。一般是用吸管吸取悬液后在30～40 cm左右处滴片，每张玻片上滴2～3滴，并用口轻轻吹散，马上放入80℃的烤箱中，以助染色体分散、固定在玻璃片上。滴片数为4张内。一张用于显带时预实验，二张用于发报告，另外一张备用，如需要便可用于C带，N带等实验，节约时间。

1.4.5 G显带技术 烤片时间应根据当前的空气湿度，灵活把握时间，湿度大烤片时间可延长;湿度小烤片时间可缩短，我们实验室一般烤片时间为80℃，3 h。准备立式染色缸3个：一缸为含0.025%胰酶的磷酸盐缓冲液(pH7.4);另两缸为生理盐水。显带时，玻片放入37℃恒温箱中预温过的0.025%胰酶溶液中处理30 s左右(具体时间应做预实验)，并不断摇动玻片，使标本均匀接触液体。然后取出迅速投入生理盐水缸中漂洗，每次3s。漂洗后的玻片用配制好的Giemsa染液染色，时间为5 min(具体时间应做预实验)，用流水冲掉染液、晾干，必要时封片、镜检。镜检时，先在低倍镜下选择分散好、长度适中的分裂相，然后转换油镜观察其显带情况。这里需要提醒的是胰酶预温时要注意预温温度，温度过高可使胰酶变性失效，温度过低胰酶活性不强，胰酶最适温度为37℃;相同浓度，来源于猪、羊、牛的胰蛋白酶在G显带中的作用不尽相同，其中牛胰蛋白酶具有使染色体拉长的作用［4］;染色体在胰酶中的处理时间可因制片质量、片龄、烤片时间长短而不同;在不同个体的染色体制片中也可有差异;在进行预实验时，应片头，片中，片尾处尽可能多观察染色体的显带情况，以便摸索出最佳的胰酶处理时间。最佳的显带结果是三分一的分裂相显带略过，三分一的分裂相显带刚好，三分一的分裂相显带略欠。

2 染色体G显带失败标本的补救

G显带常常由于各种因素导致显带不够，不能进行准确的核型分析，可以用无水乙醇或甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定液对由于胰蛋白酶消化时间短而致的失败标本进行重新处理，收到了理想的效果。

2.1 无水乙醇脱色法 将未经油镜观察后无香柏油的标本片放人无水乙醇中漂洗1～2 min，放在80℃烤箱烘烤10 min，取出后放人0.025%胰酶溶液中消化1 min，染色时间不变［5］。

2.2 甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定液脱色法 将经油镜观察后有香柏油的玻片放入甲醇∶冰醋酸(3∶1)固定液中浸泡1 h，取出后放80℃烤箱烘烤10 min，然后进行消化、染色。消化染色时间同无水乙醇脱色法［5］。

3 讨论

染色体结构或数目异常所致疾病为染色体病。现巳发现人类染色体数目和结构畸变3000余种，染色体病综合征100余个［6］。每一位染色体病患者都会对家庭、社会造成沉重的精神和经济负担，许多家庭由此因病致贫，因病返贫。检出平衡易位携带者、发现染色体异常是我们每位细胞遗传工作者的责任。同时加强产前诊断，防止染色体病患儿的出生，对提高人口素质有重大意义。

［1］李洁，徐文瑜，杨娇英.外周血淋巴细胞培养及染色体G带标本制备的实验对策.中国优生与遗传杂志，2006，14(1)：51-51．

［2］康晓慧.细胞生物学.北京：人民卫生出版社，2003：240-241．

［3］白玉书.白玉书专辑.北京：中国人事出版社，2000：240．

［4］高丽君，宋芳，周立社，等．不同来源胰蛋白酶对染色体G显带的影响. 包头：医学院学报，2006，22(1)：77-78．

［5］张颖珍．人体外周血染色体G显带制备时的影响因素及补救措施. 中国优生优育，2010，16(5)：265-267．

［6］临床常见染色体病诊断手册.北京：人民卫生出版社，2001：11．