溶菌酶的研究与应用

吴连春，张秀玲

1.河北联合大学，河北 唐山 063020 2.河北联化学工程学院，河北 唐山 063009

溶菌酶，全称为1，4-β-N-溶菌酶，又称胞壁质酶或粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶,是一种对微生物的细胞壁特别是致病细菌中的黏多糖具有专门作用的水解酶，通过切断N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之间的β-1，4糖苷键联结，解体肽聚糖支架，从而在内部渗透压的作用下使细胞胀裂，细菌裂解。溶菌酶还可与带负电的病毒蛋白结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒丧失活性。因此溶菌酶具有抗菌、消炎、杀毒等作用[1-2]。

由于溶菌酶能够选择性地分解微生物的细胞壁，并且自身没有毒害，因此作为一种天然、安全的杀菌剂和防腐剂，在食品工业、医药制剂、日用化工等行业被普遍重视。随着开发和应用研究的进一步深入，溶菌酶的发展前景将会十分广阔。

1 溶菌酶的结构与性质

溶菌酶是一种葡萄糖苷酶，其中鸡蛋清溶菌酶是目前研究最清楚的一种溶菌酶，它是由18种129个氨基酸残基2200个原子组成的单肽链蛋白质，分子量14388～18000[3]。

纯品溶菌酶为粉末状白色结晶，无嗅、味甜，易溶于水、乙醇，不溶于丙酮、乙醚等[4]；在酸性溶液中其化学稳定性和热稳定性均较强，在pH=3，100oC条件下加热处理45min仍保持活性 ；在碱性条件下化学性质不稳定，易被破坏，热稳定性也很差[5]。

2 溶菌酶的分离纯化方法

由于溶菌酶的来源众多，其分离纯化的方法也有多种。目前主要有直接结晶法、离子交换层析法、亲和层析法以及超滤法、膜色谱法和反胶团法等。

2.1 直接结晶法

结晶法是提取溶菌酶的传统方法，原理是在蛋清中加入一定量的中性盐如氯化物、碘化物或碳酸盐等盐类，再调节至溶菌酶的等电区静置，即可有溶菌酶晶体慢慢析出，而大多数蛋白质却仍留在溶液中，经过滤得溶菌酶结晶，通过重结晶可获得精致的溶菌酶。

此法设备简单、操作容易、投资不大。但由于结晶过程中的条件不易控制，且溶菌酶容易失活，影响质量；同时处理后的蛋清不易回收利用，使成本增大。

2.2 离子交换层析法

离子交换层析法用于溶菌酶分离始于上世纪8O年代，具有操作简便、成本低、效率高的特点，并可重复使用及实现大规模连续自动操作，因此而成为溶菌酶生产的常用方法[7]。

通常选择弱酸性阳离子交换树脂进行分离。目前用于溶菌酶分离纯化的离子交换剂主要有Duolite-464、724、732型弱酸性阳离子交换树脂，D903、D201大孔离子交换树脂，CM、DEAE-纤维素，羧甲基纤维素（CMC）和羧甲基琼脂糖，CM.Sephadex阳离子交换树脂，Duolite C-464树脂，CM.Toyope.树脂，大空隙苯乙烯系强碱性阴离子交换吸附树脂等[6，8]。

2.3 亲和层析法

亲和层析法是利用蛋白质或酶与其配体之间的专一性亲和力，使酶与底物形成复合物，在一定条件下进行分离而得到纯净酶的方法。常用的吸附剂为几丁质及其衍生物，如：几丁质粉、羧甲基几丁质、几丁质包埋纤维素、脱氨几丁质粉、N-酰化壳聚糖、脱氨再生几丁质凝胶等[9]。

此法对各种来源的溶菌酶均可应用，对经化学修饰而失活的溶菌酶也能进行分离纯化。但仅适用于分离纯化微量溶菌酶，大规模生产尚难以适用。

2.4 超滤

超滤法是一种新兴分离纯化技术，是通过控制超滤膜孔径大小，来滤除杂质、水及小分子物质，从而达到分离获得产物的目的[8]。

超滤法的优点是可以获得高产量和高纯度的产品，将超滤法与结晶法、离子交换法或亲和色谱法等结合使用，可进一步提高纯度，获得精制溶菌酶。

2.5 膜色谱法

膜色谱技术是将膜分离与液相色谱相结合的一种新型分离技术，其中亲和膜色谱法兼具了膜分离与亲和分离的特点，具有纯度高，压降小，分离快等特点，且在分离过程中生物大分子变性几率小，容易实现规模化生产[10]；离子交换膜色谱法则是通过膜介质表面的基团与目标蛋白质进行离子交换而进行分离的，其特点是操作条件温和，蛋白质不容易失活[11]。

2.6 反胶团法

反胶团萃取是通过在有机溶剂中加入适量表面活性剂，在溶液中形成的反胶团来进行分离纯化的方法，是近年发展起来的一种新的萃取方法，为有机溶剂萃取技术的应用扩大了范围[11]。

3 溶菌酶活性复性与活性测定

3.1 溶菌酶的活性复性

在溶菌酶的生产或应用过程中，由于工艺条件或环境因素的变化，容易造成酶失活变性，因此需要通过采取适当措施，保持或恢复溶菌酶的活性，从而减少损失。如Karuppiah等[12]研究表明，向复性溶液中加入适量的β-环糊精，可使变性的碳酸脱水酶的复性率达到80%。

3.2 溶菌酶的活性测定

测定溶菌酶活性的方法，主要有比浊法、琼脂板扩散法、紫外分光光度法、比色测定法、琼脂火箭糖电泳法和高效液相色谱法等。这些方法各有不同特点，其中比浊法和琼脂板扩散法方法较为常用，但干扰因素多，实验结果的重现性差。琼脂火箭糖电泳法和高效液相色谱法的测定效果最为理想[13]，简便快速、稳定灵敏，测量结果准确可靠，是比较好的方法。在比浊法基础上改进的微量快速比浊检测溶菌酶的方法具有快速、准确、灵敏的特点。

4 溶菌酶的应用

4.1 在食品工业中的应用

溶菌酶作为一种无毒、无副作用安全性很高的天然蛋白质，成为食品防腐剂和营养保健品的优选对象。现已应用于如水产品、乳制品、肉食品、糕点、料酒、清酒及饮料等产品。溶菌酶的杀菌属于冷杀菌，因此可以避免高温杀菌对食品营养和风味的破坏作用。将溶菌酶添加到乳粉中，能使牛乳人乳化。

4.2 在生物科学研究中的应用

由于溶菌酶能破坏细菌细胞壁，因此用溶菌酶处理格兰氏阳性细菌能得到原生质体，可用于菌体内容物质的提取。在适当缓冲条件下用溶菌酶处理对溶菌酶敏感的菌体悬浮液，再经超声波、冷冻、离心分离等方法进一步精制，所得的菌体物质，可用以提取制造核酸、酶及活性多肽等活性物质[14]。随着生物科学的发展，溶菌酶已成为基因工程、细胞工程、发酵工程中非常重要的工具酶，对溶菌酶制剂的需求量也与日俱增 。

4.3 在医疗中的应用

作为酶类抗菌药，溶菌酶能参与黏多糖的代谢，如配合内服与外用药，可使其对微生物的感染发挥出更强的消炎作用。溶菌酶具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，并具有多种药理作用，因此广泛用于副鼻窦炎、咽喉炎、扁平苔藓的治疗。还可用于预防和治疗病毒性肝炎，尤其对输血后肝炎及急性肝炎的效果较为显著。

5 结论

溶菌酶作为一种天然蛋白质，具有抗菌、杀毒和消炎等作用，并能在胃肠内促进营养物质的消化与吸收，对人体没有毒害，集药理、保健和防腐3种功能于一体，是一种安全性很高的食品保鲜防腐剂、营养保健品和药品。

由于溶菌酶来源广泛，不同来源溶菌酶又有其不同的特殊性，因此，应充分研究掌握不同溶菌酶的酶学特性，同时研究不同条件如pH值、离子强度等因素对其活性的影响，探究酶活优化条件和调空方法。另外，作为防腐剂使用溶菌酶时，应先弄清楚是何种微生物导致食品腐败，以便对症下药，确实发挥防腐作用。另外，还应研究不同来源溶菌酶之间及与其他物质配合使用的协同作用。

我国溶菌酶的研究、应用起步较晚，目前国内蛋清溶菌酶年产量不足50t，特别是高活性的溶菌酶供应还不能满足日益增长的需求。我国生物酶工程研究已多次列为国家“863”计划及“十五计划”等的重点科研攻关项目。随着我国经济的腾飞和生物、化工等工业的发展，对溶菌酶的需求量在不断增加。因此，研究、开发和扩大溶菌酶的生产有着广泛的发展前景。

[1]李鹤，马力，王维香.溶菌酶的研究现状[J].食品研究与开发，2008，29(1)：182-185.

[2]Blake CCF，Koening DF，Mair GA，et a1.Structure of hen eggwhite lysozyme[J].Nature，l965(206)：757

[3]林向阳，何承云，等.溶菌酶及其应用研究[J].中国食品添加剂，2005(6).

[4]张勇，胡其标，等.溶菌酶及其在食品工业中的应用[J].粮油加工与食品机械，2004(3).

[5]谭斌.食品工业科技，1998(5)：32-33.

[6]方元超，梅丛笑，尹宁.溶菌酶及其应用前景[J].中国食品添加剂，1999(4).

[7]陈慧英，吴晓英，林影.溶菌酶分离纯化方法的研究新进展[J].广东药学院学报，2003，19(4)：356-358.

[8]黄建安，欧阳建华.溶菌酶制备技术研究进展[J].江苏食品技术与发酵，2002，2：20-23.

[9]林亲录，马美湖.鸡蛋卵清中溶茵酶的提取与纯化[J].食品科学，2002，2(23)：43-46.

[10]甘宏宇，商振华，王俊德.亲和膜色谱技术研究进展[J].分析化学，1999，27(1)：111.

[11]陈慧英，吴晓英，林影.溶菌酶分离纯化方法的研究新进展[J].广东药学院学报，2003，19(4)：356-358.

[12]Karuppiah N et al.Biochem Biophys Res Commun，1995，211(1)：60-66.

[13]洪潇，余若黔.溶菌酶的活性测定方法[J].生物技术通报，2004，5：40-42.

[14]Paola Appendini and Joseph H.Hotchkiss.Immobilization of Lysozyme on Food contact Polymers as Potential Antimicrobial Films[M].Packaging Technology and Science，1997：271-279.