介绍一种皮肤刺激体外替代新方法

【作者】孙立魁，候丽，施燕平

山东省医疗器械产品质量检验中心；山东省医疗器械生物学评价重点实验室

在医疗器械生物学评价方面，皮肤刺激试验目前仍采用家兔法进行安全性试验，而运用减少（Reduction）、替代（Replacement）、优化（Refinement）动物试验的3R原则和采用动物试验替代方法进行安全评价，已成为欧洲社会努力实现的目标之一，我国GB/T16886《医疗器械生物学评价-第2部分：动物保护要求》目的也是使实验室动物的数量和应用减少到最低量。皮肤刺激体外替代新方法EpiSkinTM、改良EpiDermTMSIT和SkinEthicTMRHE方法就是使用体外重组人皮肤表皮模型来代替动物实验，从而达到保护动物的要求。此方法经过ECVAM（欧洲替代方法验证中心）大约10年时间的验证，证实具有较高的灵敏度、特异性和准确度，所以2010年7月最终被OECD TG439采纳用来代替家兔Draize法来进行皮肤刺激试验。下面就简要介绍一下皮肤刺激体外替代新方法及其是如何被ECVAM验证的。

1 方法

将受试物均匀涂布于体外重组人皮肤表皮模型上，接触一定时间后用MTT法测试细胞存活率[1]，若存活率≤50%提示有刺激性。

1.1 表皮模型

法国欧莱雅集团经过20年研究，从一些乳房整形手术中获得表皮角化细胞(Keratinocytes)，在铺满胶原质(collagen)培养器中培养两到三周，具有较强繁殖功能的角化细胞不断分化、成层，最终成长为类似于人类表皮的皮肤组织（见图1、图2）。

图1 正常人皮肤表皮结构Fig.1 Structure of normal epidermis

图2 体外重组人皮肤表皮结构Fig.2 Vitro restructure of normal epidermis

它具有原始皮肤细胞典型的器官结构和超微结构，可以像真实皮肤一样不断生长，有皮肤屏障功能，在阳光下暴露一定的时间会变黑，能表现一些人逐渐变老的特征，甚至还可以表现人愤怒时的迹象，非常适合用于皮肤刺激体外替代试验，已经商品化的有EpiSkinTM、EpiDermTMSIT和SkinEthicTMRHE等。EpiskinTM标准试剂盒每盒包含有12个表皮亚单位。

1.2 方法

(1) 将液体受试物（10±1）μL直接滴在表皮表面，固体受试物（10±2）mg，用小匙小心平铺于表皮表面，在37oC5%CO2孵箱中孵育15 min之后，每块表皮至少用10 mLPBS清洗一次，然后再孵育18 h，让受试物与组织充分作用[2]。

(2) 将表皮与MTT溶液在37oC5%CO2孵箱中孵育3 h，避光放置，分离表皮和胶原基质，在室温中置于酸性异丙醇（0.04mol/L, 840 μL）18h。

(3) 将萃取物(200μL)转移到96孔板，在570 nm测OD值，酸性异丙醇为空白对照。对照表皮的OD值必须界于0.6-0.9，并且5%SDS处理的阳性对照表皮的细胞活性在0-20%之间。

(4) 每个受试物需要作用于三个表皮，并用三个批号的皮肤模型产品。如果细胞的存活率≤50%，则受试物具有刺激性。

2 ECVAM对优化的试验方法的验证

三个实验室各自用三种方法分别测试58种编码的化学物，通过对实验室内、实验室间测试方法的可重复性和可预见性评估，最终研究表明， EpiSkinTM、改良EpiDermTMSIT 、SkinEthicTMRHE可以代替Draize皮肤刺激试验：R38，被EUTMB.46 & OECD TG 439采纳[3]。

表1 EpiSkinTM、改良EpiDermTMSIT和SkinEthicTM RHE实验室内、间重复性比较Tab.1 Comparison of EpiSkinTM, improved EpiDermTMSIT and SkinEthicTM RHE

表2 EpiSkinTM、改良EpiDermTMSIT和SkinEthicTM RHE比较Tab.2 Comparison of EpiSkinTM, improved EpiDermTMSIT and SkinEthicTM RHE

3 讨论

(1) 传统Draize法皮肤刺激试验需要使用家兔对受试物进行试验，使用动物数量多，具有刺激性的受试物给动物带来极大的痛苦，而GB/T16886-2《医疗器械生物学评价 第2部分：动物保护要求》明确表明动物保护的最终目的是废除动物试验，减少生物学试验中动物用量，完善试验方法以减轻或消除动物的疼痛，以及用其他方法替代动物试验[4]。所以从医疗器械生物学评价动物保护角度考虑应该采用新方法替代动物实验。

(2)EpiSkinTM、改良EpiDermTMSIT和SkinEthicTMRHE方法经过权威组织ECVAM验证，证实具有较高的灵敏度、特异性和准确度，实验室内、实验室间重复性和可预见性好，所以被OECD正式采纳用来代替家兔Draize法来进行皮肤刺激试验。

(3) 我国医疗器械生物学评价体外替代方法研究起步较晚，发展较慢，但应尽快与国际接轨，采用更多的体外替代试验方法来取代传统的动物试验，且在GB/T16886-1《医疗器械生物学评价 第1部分：评价与试验》也提到只要科学上证明能获得与动物试验同样的信息，建议优先采用体外模式，希望此方法尽快被GB/T16886-10《医疗器械生物学评价 第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验》引用，掀起新一轮动物试验替代高潮，为医疗器械生物学评价替代方法领域提供了更加广阔的空间。

[1]C.Faller, Predictive ability of reconstructed human epidermis equivalents for the assessment of skin irritation of cosmetics[J],Toxicology in Vitro, 2002, 16,（5）557-572.

[2]彭双清, 郝卫东, 伍一军.毒理学替代法[M], 北京, 军事医学科学出版社, 2009

[4]中华人民共和国国家标准《医疗器械生物学评价 第2部分: 动物保护要求》[S].GB/T16886.2-2000 idt ISO10993-2:1992