非综合征型耳聋线粒体基因突变的检测

刘 涛 ，李建瑞 ，严江伟 ，李玲香 ，王利伟 ，

1.北京市垂杨柳医院耳鼻咽喉科，北京 100022；2.中国科学院北京基因组研究所，北京 100029；3.内蒙古医学院附属医院耳鼻喉科，内蒙古呼和浩特 010059

耳聋是最常见的残疾之一，其发病率高、病因复杂、治疗困难，给个人、家庭及社会带来巨大的压力和沉重的负担。据各国统计，每1000名新生儿中，有1～3例听力障碍儿童，其中至少一半与遗传因素有关。研究表明，线粒体（mtDNA）12SrRNA基因A1555G点突变能引起氨基糖苷类药物敏感性耳聋（aminoglycoside antibiotics induced deafness，AAID）[1]，占遗传性聋1%～2%[2]。目前国内用于检测线粒体 12S rRNA基因第1555位A＞G均质性突变的方法为：PCR扩增线粒体DNA片段，限制性内切酶分析（RFLP）和 DNA序列分析[3]。本文采用常规流行病学的研究方法结合分子生物学的手段，于2006年7月～2010年10月对内蒙古鄂尔多斯市特殊教育学校102名非综合征型感音神经性耳聋患者的mtDNA A1555G点突变进行检测，以了解耳聋和该突变的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择内蒙古鄂尔多斯市特殊教育学校学生102例。这些学生从内蒙古鄂尔多斯市下属的各个旗、县招生。其中，男56例，女46例；年龄6～23岁，平均15.65岁；蒙古族10例，汉族92例。

1.2 方法

1.2.1 病史资料采集 首先，通过学校给家长或监护人发放知情同意书；然后由学生和家长共同填写调查问卷。问卷包括患者的一般情况，如姓名、性别、出生年月；特别要关注患者的耳聋病史、家族中是否有同样的耳聋患者、是否用过耳毒性药物、耳聋是否与外伤有关、是否患过腮腺炎等可以引起耳聋的传染病疾病史。对患者的耳鼻喉科进行正规的专科检查和听力学评估。对所有患者行纯音测听和声导抗检查。在学校对所有患者抽取外周静脉血3 ml，低温冷冻保存。在实验室进行全基因组DNA的提取，然后进行A1555G点突变的筛查。

1.2.2 基因组DNA的制备 用DNA提取试剂盒（QIA amp DNA Blood Mini Kit 250）提取耳聋患者的全基因组DNA，取适量用紫外分光光度计进行纯度检测，将提取的DNA置于-80℃冰箱保存备用。

1.2.3 引物设计与合成 用Primer 3 input数据库设计引物，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。正向引物序列：5'-CCGCCATCTTCAGCAAACCCTG-3'；反向引物序列：5'-TAGTAAGGTGGAGTGGGTTTGG-3'。

1.2.4 PCR扩增 PCR反应体系包括1×PCR缓冲液、1.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、0.2 mol/L 正反向引物、40 ng 基因组DNA、1U TaqDNA聚合酶（PCR反应试剂均为北京Fermentas公司产品），去离子灭菌水补足至20 μl。PCR反应在 DNA热循环仪（BIO RAD PTC-200，美国BIO RAD公司）上进行。反应条件：95℃预变性 3 min，95℃变性 30 s，62℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，经 30个循环，最后 72℃延伸 10 min。4℃保存。PCR产物 4 μl与1 μl溴酚蓝混合，1.5%琼脂糖凝胶电泳（120 V，40 min），DL2000 DNA Ladder（北京天根公司）标记，化学发光成像系统下进行PCR产物鉴定。

1.2.5 限制性内切酶分析 酶切总体系30 μl，针对mtDNA 12SrRNA的PCR扩增产物，经琼脂糖凝胶电泳验证后取10 μl，加入Alw26I（酶切位点：5'-GAGAC）限制性内切酶（北京 Fermentas公司）1 μl，Buffer Tango 缓冲液 2 μl，去离子灭菌水补足至30 μl。酶切条件：37℃水浴箱中温育消化过夜，经琼脂糖凝胶电泳验证，酶切切开者为150 bp和295 bp两个条带，为突变阴性；如只见445 bp的一个条带，说明存在mtDNA A1555G突变；均设阳性和阴性对照。不能切开的或是酶切显示不清的送测序验证。

1.2.6 DNA序列测定 扩增出的PCR产物经QIAGEN PCR纯化试剂盒纯化，纯化产物经电泳证实后，再做Cycle Sequencing反应。用扩增模扳的引物行测序反应，然后在3100毛细管测序仪上该片段进行DNA序列测定。取DNA库内正常人混合基因组DNA做正、反向测序，作为单链DNA测序的阳性对照。 反应条件：95℃预变性 2 min，95℃变性 10 s，50℃退火5 s，60℃延伸4 min，循环25次。反应产物用Gentri-Sep Spin columns除去过量的dye terminators保证反应产物适合在3100毛细管测序仪内进行。测序结果经过3100测序分析系统软件进行分析。

2 结果

2.1 病史资料

聋哑学校的102例非综合征型耳聋患者中，三代人中可发现2例耳聋患者的有11例，1例是父母近亲结婚，其余均为散发性耳聋。

2.2 听力损失评估

极重度聋占大多数，共89例，其次是重度聋，共10例，中度聋和中重度聋3例。声导抗测试：鼓室压图：大多数为A型鼓室曲线共58例；其次是As型鼓室曲线共30例；B型鼓室曲线共13例；Ad型鼓室曲线仅有1例。镫骨肌反射：57例双耳都没有引出镫骨肌反射，31例可引出镫骨肌反射者，但反应阈较高，另外14例听力较好耳可引出镫骨肌反射。1.5岁以下发现耳聋82例，1.5～5.0岁发现耳聋20例。

2.3 药物性耳聋情况

用氨基糖苷类抗生素后发现耳聋54例。其中以使用庆大霉素最多见为33例，其次是链霉素共13例。卡那霉素与上述二种药物联合使用2例。三种药物两两联合使用5例，三种联合使用1例。因感冒发热使用48例，其他病因使用6例。

2.4 线粒体A1555G基因突变酶切结果

本实验扩增的片段是从线粒体基因核苷酸1261到1705，PCR产物共有445 bp。含有GAGAC核苷酸序列的DNA片段可被限制性内切酶Alw26I识别。如果发生突变，这个识别位点消失，PCR产物不被酶切，经该酶孵育过的电泳检测仍为445 bp一条带；如果未发生突变，扩增产物被酶切后就被分为295 bp和150 bp两个片段。7例患者的PCR产物经Alw26I酶切后无识别位点的丢失，电泳检测为一条445 bp的带，阳性率是6.9%（7/102），有氨基糖苷类用药史54例，该点突变的发生率为13.0%（7/54）。部分病例酶切结果见图1。

图1 部分病例酶切结果

2.5 mtDNA 12SrRNA A1555G基因测序结果

7例存在线粒体基因A1555G位点突变，与酶切结果相吻合。见图2。

3 讨论

人类线粒体是一个双链闭环分子，由16569 bp的核苷酸序列组成。与其他细胞器诸如溶酶体和过氧化物酶等特化膜结构相比，线粒体具有自己的遗传物质，因而是一种半自主复制体。这是指mtDNA能够独立地复制、转录和翻译[4-5]。当mtDNA出现突变时，核苷酸序列和空间结构发生改变，导致mtDNA亚单位rRNA的结构与细菌蛋白核糖体的结构极为相似，改变了结构的rRNA与氨基糖苷类抗生素有极高的亲和力。而野生型rRNA却不能与氨基糖苷结合[6]。这是氨基糖苷类抗生素致聋的的机制之一。

在临床工作中，有的患者由于患有结核病等原因，使用氨基糖苷类抗生素可达3个月之久，却没有发生听力下降；有些患者仅用了少量的氨基糖苷类抗生素，结果发生了极为严重的听力下降而导致聋哑症。可见个体对氨基糖苷类抗生素的敏感性有巨大的差异性，这是由基因决定的。本研究资料也说明，该地区有明显的抗生素滥用倾向，只要有发热就使用氨基糖苷类抗生素。因此，停止滥用抗生素对降低耳聋的发生也是非常有效的方法之一。由于本研究有7例患者存在mtDNA A1555G点突变，全部有氨基糖苷类抗生素用药史，说明mtDNA A1555G点突变是他们患病的遗传学基础。但是，另外的47例却没有检测到该位点的的突变，不能排除mtDNA其他位点的突变；如线粒体A7445G点突变，C1494T等的点突变[2-7]。也不能排除核基因的调控和环境因素的影响。贾婧杰等[8]对山东省滨州市特教学校74例耳聋学生进行了12S rRNA基因A1555G点突变的检测，5例为阳性，阳性率为6.76%（5/74）与本文结果一致。该群体线粒体A1555G位点的突变率高于以往的报道，携带有该突变的个体对氨基糖苷类抗生素有高度易感性，因此该基因突变是感音神经性耳聋的原因之一。鲍晓林等[9]对西北地区245例患者行A1555G点突变检测，86例有氨基糖苷类药物应用史，检测到21例线粒体DNA 12SrRNA A1555G同质型突变，突变检出率为24.4%（21/86）；在东北地区188例患者中，66例有氨基糖苷类药物应用史，检测到2例同质型突变，1例异质性突变，突变检出率为4.5%（3/66）。两地区比较差异有统计学意义，西北地区线粒体DNA 12SrRNA A1555G突变检出率显著高于东北地区。

由于本次研究只针对内蒙古鄂尔多斯聋哑学校学生进行检测，这些学生大多为重度-极重度非综合征型耳聋患者，而本文只检测了mtDNA A1555G突变，还应有该基因其他位点的突变。所以内蒙古鄂尔多斯地区的线粒体基因突变的频率应该高于单个点突变6.9%的比率。这一地区mtDNA高突变率的遗传学因素，氨基糖苷类药物的高使用率是这一地区高聋哑症发生率的原因。因此，氨基糖苷类抗生素的使用应该非常慎重，对非用不可的患者要仔细询问其耳聋家族史，进行mtDNA A1555G点突变的检测，对该位点阴性的个体先行常见其他位点的检测，必要时行全部基因组mtDNA的检测。如果有mtDNA的点突变则避免使用氨基糖苷类抗生素，防止人为因素造成的听力损害。这对防聋将产生重大而深远的意义。

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