丙泊酚对血管紧张肽Ⅱ诱导心肌细胞肥大及ROS/JNK1/2通路的影响

周武，张俊峰，王涛

(1.湖北省新华医院麻醉科，武汉 430015;2.华中科技大学同济医学院药学院，武汉 430030)

心肌细胞肥大是高血压等多种常见心血管疾病的并发症，其发展可加重心肌组织缺血缺氧状态，增加猝死发生率;降低心室顺应性，并影响心肌细胞间力的产生与传输，终致心律失常及不可逆心力衰竭［1］。血管紧张肽 Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)可促进活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成，活化 c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-teminal kinase1/2，JNK1/2)，促进蛋白质合成及体积增大等心肌细胞肥大反应［2-3］。现有研究提示在危重患者体内血管紧张肽系统活性上调［4］。丙泊酚(propofol，Pro)被广泛应用于危重患者手术中的持续静脉镇静。作为一种抗氧化剂，丙泊酚能拮抗活性氧导致的多种细胞损伤，具有一定的心肌保护作用［5］。但其是否能抑制心肌肥大，尚未可知。笔者在本研究拟探讨丙泊酚对AngⅡ诱导的心肌肥大的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 1～2 d龄新生Wistar乳鼠，购于华中科技大学同济医学院实验动物中心。动物许可证号SCXK(鄂)2004-0007。

1.1.2 试剂与仪器 AngⅡ(Sigma公司)、丙泊酚标准品由德国费森尤斯公司惠赠、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco＇s modified eagle＇s medium，DMEM)干粉培养基、胰酶、胎牛血清(Gibco公司)，［3H］-亮氨酸(中科院上海原子能研究所)，硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，NC 膜，Amersham 公司)，小鼠抗大鼠JNK1/2单克隆抗体及增强荧光显示剂(Santa Cruz公司)。其余试剂为国产分析纯。垂直电泳仪及转膜系统(Biorad公司)。

1.2 方法

1.2.1 心肌细胞培养及分组 1～2 d龄新生Wistar乳鼠置于超净工作台上，常规取心室肌，用D-Hanks液于4℃漂洗，剪成1mm3体积碎块，0.1%胰酶消化成细胞悬液，差速贴壁1 h后，将心肌细胞用含20%胎牛血清及青霉素、链霉素的DMEM培养液稀释后，均匀接种于6孔板，置于37℃、5%二氧化碳(CO2)培养箱培养2 d，换无血清培养液。参考文献［6］所用浓度，按给予培养基中试剂的不同分为如下几组:①对照组，给予培养基;②Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)组;③AngⅡ(0.1 μmol·L-1)+Pro(3 μmol·L-1)组;④Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(10 μmol·L-1)组;⑤Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(30 μmol·L-1)组。

1.2.2 相差显微镜下观察细胞直径 含各种浓度干预因素的无血清培养液继续培养24 h。相差显微镜观察并摄相，随机取6个视野，计算细胞直径，并与对照组进行对比。

1.2.3 ［3H］-亮氨酸掺入率测定 参考文献［7］方法。细胞用无血清培养液培养24 h后，加入各组处理因素及［3H］-亮氨酸18.3 kBq继续培养24 h。弃培养液，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)冲洗2次，0.25%胰酶消化后收集于玻璃纤维素膜，10%三氯乙酸固定，滤膜烘干后用LS3810液体闪烁仪测定样品的每分脉冲数(cpm)。结果以对照组细胞［3H］-leucine掺入率作100%，各组均以［3H］-leucine掺入百分率表示。

1.2.4 细胞内 ROS水平分析 参考文献［8］方法。在细胞培养第4天，D-Hanks液洗细胞1次，以DCFHDA(5 μmol·L-1)在37℃下避光孵育30 min。各组处理30 min后，PBS漂洗2次，并以0.25%胰酶消化细胞。荧光分光光度计在激发光波长485 nm、发射光波长535 nm下观察细胞内产生荧光强度的变化，反映细胞内ROS水平。

1.2.5 还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶活性(NADPH oxidase，Nox)测定 参考文献［9］方法。胰酶消化细胞后，4℃下2 500×g离心5 min，以 PBS 再悬浮，随后加入 250 μmol·L-1NADPH孵育，在λ=340 nm下观察5 min，通过吸光率的减少来探测NADPH的消耗量。为分析NADPH氧化酶特异的活性，在检测之前30 min加入10 μmol·L-1DPI，来检测DPI抑制后的NADPH消耗率(the rate of consumption of NADPH inhibited by DPI)。用来计算NADPH消耗总量的吸收消光系数(absorption extinction coefficient)是 6.22mmol-1·cm-1，结果以pmol NADPH·min-1·mg-1蛋白表示。

1.2.6 免疫印迹法检测JNK1/2磷酸化 取总蛋白30 μg加入上样缓冲液煮沸3 min变性，经十二烷基磺酸钠/聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至NC膜，封闭后与稀释一抗4℃孵育过夜，并与稀释二抗室温孵育1 h，再与化学发光试剂温浴1 min后曝光、显影和定影，最后对结果进行吸光度扫描分析。

2 结果

2.1 Pro对AngⅡ诱导的心肌细胞直径增加的影响

刺激因素处理24 h后，相差显微镜测定心肌细胞直径。结果显示，对照组细胞直径为(22.29±23.78)μm;AngⅡ能显著提高细胞直径，各浓度Pro均使AngⅡ诱导心肌细胞直径明显减少，以上结果差异有统计学意义。见图1。

2.2 Pro对AngⅡ诱导的心肌细胞蛋白合成速率上调的影响 结果显示，对照组细胞［3H］-亮氨酸掺入率为(2 175±285.6)cpm;AngⅡ作用24 h后，心肌细胞蛋白质合成速率较对照组明显增加，各浓度Pro能减弱AngⅡ诱导心肌细胞内蛋白合成速率的增加，差异有统计学意义。见图2。

图2 Pro对蛋白质合成速率的影响(n=6)A.对照组;B.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)组;C.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(3 μmol·L-1)组;D.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(10 μmol·L-1)组;E.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(30 μmol·L-1)组;与对照组比较，*1P＜0.01;与 Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)组比较，*2P＜0.05，*3P＜0.01Fig.2 Effects of propofol on protein synthesis rate(n=6)A.the control group;B.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)group;C.AngⅡ(0.1 μmol·L-1)+Pro(3 μmol·L-1)group;D.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(10 μmol·L-1)group;E.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(30 μmol·L-1)group;Compared with the control group，*1P＜0.01;Compared with the Ang Ⅱ group，*2P＜0.05，*3P＜0.01

2.3 Pro对AngⅡ诱导的心肌细胞ROS水平增加的影响 结果显示，对照组细胞 ROS荧光强度为(16.22±1.89);AngⅡ作用24 h后，心肌细胞蛋白质ROS水平较对照组明显增加。各浓度Pro处理后，ROS水平明显降低，差异有统计学意义。见图3。

2.4 Pro对AngⅡ诱导的心肌细胞NADPH氧化酶活性上调的影响 结果显示，对照组细胞NADPH氧化酶活性为(3.621±0.396)pmol·min-1·mg-1;Ang Ⅱ作用24 h后，心肌细胞Nox活性较对照组明显增加。各浓度Pro处理后，Nox活性明显降低，差异有统计学意义。见图4。

2.5 Pro对AngⅡ诱导的心肌细胞JNK1/2磷酸化增强的影响 为证实Pro对AngⅡ诱导的心肌细胞JNK1/2磷酸化是否有抑制作用，免疫印迹法检测各组p-JNK1/2蛋白表达，结果示:对照组p-JNK1/2蛋白表达(相对吸光度)为(0.45±0.09);AngⅡ作用 24 h后，心肌细胞总-JNK1/2(t-JNK1/2)无显著改变，而p-JNK1/2蛋白表达较对照组明显增加，而各浓度Pro处理后能显著抑制AngⅡ诱导的JNK1/2磷酸化，差异有统计学意义(P＜0.05 或 P＜0.01)。见图5。

图3 Pro对ROS水平的影响(n=6)A.对照组;B.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)组;C.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(3 μmol ·L-1)组;D.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(10 μmol ·L-1)组;E.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(30 μmol·L-1)组;与对照组比较，*1P＜0.01;与 Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)组比较，*2P＜0.05，*3P＜0.01Fig.3 Effects of propofol on ROS level(n=6)A.the control group;B.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)group;C.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(3 μmol·L-1)group;D.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(10 μmol·L-1)group;E.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(30 μmol·L-1)group;Compared with the control group，*1P＜0.01;Compared with the Ang Ⅱ group，*2P＜0.05，*3P＜0.01

图4 Pro对Nox活性的影响(n=6)A.对照组;B.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)组;C.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(3 μmol ·L-1)组;D.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(10 μmol ·L-1)组;E.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(30 μmol·L-1)组;与对照组比较，*1P＜0.01;与 Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)组比较，*2P＜0.05，*3P＜0.01Fig.4 Effects of propofol on NOX activity(n=6)A.the control group;B.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)group;C.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(3 μmol·L-1)group;D.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(10 μmol·L-1)group;E.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(30 μmol·L-1)group;Compared with the control group，*1P＜0.01;Compared with the Ang Ⅱ group，*2P＜0.05，*3P＜0.01

3 讨论

心肌细胞肥大是心肌细胞对高血压、心肌梗死及先天性心脏病等常见临床疾病的一种应答反应。长期应激所致持续性心肌肥大可增加心力衰竭和猝死风险。因此寻找有效的逆转心肌肥大的途径是目前医学研究重点。

图5 Pro对JNK1/2磷酸化的影响(n=6)A.对照组;B.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)组;C.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(3 μmol·L-1)组;D.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(10 μmol·L-1)组;E.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(30 μmol·L-1)组;与对照组比较，*1P＜0.01;与 Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)组比较，*2P＜0.05，*3P＜0.01Fig.5 Effects of propofol on the phosphorylation of JNK1/2(n=6)A.the control group;B.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)group;C.AngⅡ(0.1 μmol·L-1)+Pro(3 μmol·L-1)group;D.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(10 μmol·L-1)group;E.Ang Ⅱ(0.1 μmol·L-1)+Pro(30 μmol·L-1)group;Compared with the control group，*1P＜0.01;Compared with the Ang Ⅱ group，*2P＜0.05，*3P＜0.01

近年来，丙泊酚被广泛应用于临床，其抗氧化活性逐渐受到人们的重视。丙泊酚结构类似于内源性抗氧化剂维生素E与外源性抗氧化剂丁羟基甲苯，能有效地防治各种氧化应激损伤，机制包括清除自由基、抑制过氧化反应、抑制大鼠心肌线粒体膜通透性转换孔道开放等方面［5］。本研究结果证实，丙泊酚能显著抑制AngⅡ所上调的心肌肥大相关指标，如细胞直径、蛋白合成速率等，诱导乳鼠心肌细胞肥大，体外实验说明其参与了心力衰竭的发生、发展过程，但机制仍有待探讨。

过氧化氢、超氧阴离子及羟基统称为活性氧，能够激活AngⅡ下游的关键信号通路，介导AngⅡ诱导的心肌肥大［10］。NADPH氧化酶是胞内ROS的主要来源。本研究提示丙泊酚能显著抑制AngⅡ所上调的Nox活性及ROS水平，并能抑制ROS下游的JNK1/2磷酸化。既往动物实验以及临床研究中也发现丙泊酚具有较强的抗氧化能力［11-12］。

本研究提示，丙泊酚能抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大，机制与抑制Nox活性、减少ROS水平并抑制JNK1/2磷酸化有关。但其对其他因素(如内皮素、去甲肾上腺素等)诱导的心肌肥大有无作用，尚待进一步研究。

［1］COHN J N，FERRARI R，SHARPE N.Cardiac remodeling-concepts and clinical implications:a consensus paper from an international forum on cardiac remodeling.behalf on an international forum on cardiac remodeling［J］.J Am Coll Cardiol，2000，35(3):569－582.

［2］HINGTGEN S D，TIAN X，YANG J，et al.Nox2-containing NADPH oxidase and Akt activation play a key role in angiotensin Ⅱ– induced cardiomyocyte hypertrophy［J］.Physiol Genomics，2006，26(3):180－191.

［3］LIU J C，CHANA P，CHEN J J，et al.Inhibitory effect of trilinolein on norepinephrine-induced b-myosin heavy-chain promoter activity，reactive oxygen species generation，and extracellular signal-regulated kinase phosphor-ylation in neonatal rat cardiomyocytes［J］.J Biomed Sci，2004，11(1):11－18.

［4］ANNAT G，VIALE J P，BUI XUAN B，et al.Effect of PEEP ventilation on renalfunction， plasma renin，aldosterone， neurophysins and urinary ADH， and prostaglandins［J］.Anesthesiology，1983，58(2):136－141.

［5］XIA Z，LUO T，LIU HM，et al.L-arginine enhances nitrative stress and exacerbates tumor necrosis factor-alpha toxicity to human endothelial cells in culture:prevention by propofol［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2010，55(4):358－367.

［6］CHENG T H，LEUNG Y M，CHEUNG C W，et al.Propofol depresses angiotensin Ⅱ-induced cell proliferation in rat cardiac fibroblasts［J］.Anesthesiology，2010，112(1):108－118.

［7］PEDRAM A，RAZANDI M，AITKENHEAD M，et al.Estrogen inhibitscardiomyocyte hypertrophy in vitro.Antagonism of calcineurin-related hypertrophy through induction of MCIP1［J］.J Biol Chem，2005，280(28):26339－26348.

［8］钟蓓华，罗健东，张贵平.辛伐他汀对过氧化氢损伤的心肌细胞的保护作用［J］.医药导报，2006，25(1):16－18.

［9］张婧，王建昌，黄秀清，等.外周血单个核细胞NADPH氧化酶活性及表达与颈动脉硬化的关系研究［J］.中国老年医学杂志，2008，28(2):146－149.

［10］BENDALL J K，CAVE A C，HEYMES C，et al.Pivotal role of a gp91(phox)–containing NADPH oxidase in angiotensin Ⅱ– induced cardiac hypertrophy in mice［J］.Circulation，2002，105(3):293－296.

［11］YUMOTO M，NISHIDA O，NAKAMURA F，et al.Propofol attenuates oxidant-induced acute lung injury in an isolated perfused rabbit-lung model［J］.J Anesth，2005，19(4):287－294.

［12］ARNAOUTOGLOU H，VRETZAKIS G，SOULIOTIS D，et al.The effects of propofol or sevoflurane on free radical production after tourniquet induced ischaemia-reperfusion injury during knee arthroplasty［J］.Acta Anaesthesiol Belg，2007，58(1):3－6.