丹参醇沉渣中有效成分的再提取

范步高

(上海长征富民金山制药有限公司上海201506)

丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。所含的化学成分主要有两大类:水溶性的酚酸类化合物和脂溶性的丹参酮类化合物［1］，在现行质量标准的丹参类注射剂中，大多是以酚酸类化合物为指标成分［2］，其中丹参素(丹参素钠)具有抗血栓、抗氧化、抗炎和抗肿瘤等明显的药理活性［3-5］，随着科学的发展，人们对丹参的有效成分也有了更深一步认识，并确认了丹酚酸B是较丹参素活性更强的丹参酚酸类有效成分，并在丹参功效中占有相当重要地位，对心、脑、肝、肾等多个器官均具有保护作用，具有显著的抗脂质过氧化、抗心肌缺血及调血脂作用、清除自由基作用、内皮素和释放作用、钙通道阻滞作用、TXA2/PG12平衡调节剂作用等［6-8］。

丹参酚酸类有效成分的提纯一般采用传统的水提醇沉法［2］，但有效成分极易被沉淀的“杂质”所包裹。本文推荐简便易行的用相同浓度的乙醇对醇沉渣再提取被包裹的有效成分，以提高产品有效成分的含量和保证临床使用疗效。

1 丹参注射液酚酸类有效成分的提取现状

水提醇沉法，其原理即是利用经水提取的(酚酸类)有效成分既能溶于水又能溶于乙醇，而淀粉、无机盐、多糖、蛋白质等“杂质”则将会随着乙醇的不断加入而逐渐被析出、沉淀［9］。但酚酸类有效成分的损失也将随着醇浓度增高而增加，有较多学者都认为丹参水提液的醇沉最佳醇浓度为50% ～60%［10-15］(见表1)，而用于注射液的丹参二次醇沉最佳含醇量分别为①60%，②70%［16］。王晓泊等为提高注射用丹参成品收率及有效成分的相对含量，用大孔吸附树脂对经二次醇沉(含醇量分别为①60%，②85%)的醇沉渣进行了回收，结果使成品收率增加了14.03%，丹参素钠相对质量分数增长了15.75%，总酚酸相对含量增加了22.46%［17］，这也充分说明了在丹参醇沉过程中，确有较多量的有效成分损失在醇沉渣中。而在丹参类注射液现行国家标准［2，18-19］中，丹参的二次醇沉的含醇量均分别为①75%和②85%，所以，丹参的有效成分损失更大，但国家标准中的醇沉浓度属于纯化关键参数，不得随意变更。所以，再加之药材质量和操作水平的差异，丹参成品质量的波幅也随之成倍加大［20］(见表2)。

表1 不同醇沉工艺的有效成分量损失率/%

表2 同一厂家不同批号及不同厂家丹参注射液含量测定结果(n=8)

2 材料与方法

2.1 实验器材及试剂 w501升降恒温水浴锅(上海申生科技有限公司)，R501旋转蒸发器(上海申生科技有限公司)，SY3200超声波清洗器(上海声源超声波仪器设备有限公司)，DS-671电子秤(上海寺冈电子有限公司)，高效液相色谱仪(安捷伦1100)，紫外分光光度仪(岛津UV-2401PC)，75%醇沉渣(上海长征富民金山制药有限公司080601丹参提取)，乙醇(丹参醇沉液浓缩回收)。

2.2 检测方法

2.2.1 丹参素钠、原儿茶醛、总酚测定依据丹参滴注液质量标准［2］进行测定。

2.2.2 丹酚酸B测定照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥD)测定。

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈为流动相A，0.03%磷酸水溶液为流动相B，按表3进行梯度洗脱;体积流量为0.8 mL/min，柱温:30℃;检测波长:288 nm。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于10000。

表3 丹酚酸B检测梯度洗脱

对照品溶液的制备 精密称取丹酚酸B对照品适量，加10%甲醇制成每1 mL含丹酚酸 B 0.1 mg的溶液，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

供试品溶液的制备 取提取液，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～10 μL，注入液相色谱仪，测定，按峰面积用外标法计算其含量。

2.3 再提取工艺 取丹参75%醇沉渣(含量折算约3.1 g生药/g渣)适量，加入3倍量(mL/g)75% ～76%乙醇，50～60℃水浴，分别用旋转蒸发器旋转和超声波清洗器超声各1 h，放冷，取上清液，检测丹参素钠、原儿茶醛、丹酚酸B、总酚量。

3 结果

75%醇沉渣再提取液含量检测结果(见表4)同批次醇沉液制成品n=3。

表475 %醇沉渣再提取液含量检测结果(mg/g生药)(n=3)

4 讨论

由表4可看出，丹参75%醇沉渣中有较多的有效成分被损失，可以最简便易行的方法再提取，特别是对丹酚酸B(丹酚酸B在后续的浓缩和灭菌等高温操作中有较大部分水解成丹参素钠和原儿茶醛［21］)。综合考虑3个有效成分和总酚，旋转和超声的效果相近。若应用于生产，则可参照旋转的方式，利用原有的醇沉罐生产设备，搅拌提取，液固接触更完全，被包裹的有效成分的“转溶”效果则会更佳。

选择75%醇沉渣进行再提取，是因为(第一次)75%醇沉的有效成分损失大于(第二次)85%醇沉的有效成分损失。若有操作不当，如浓缩液的相对密度较大或醇沉用的乙醇浓度过高，则(第二次)85%醇沉有效成分损失较多时，也可对85%醇沉渣进行再提取。

采用相同浓度的乙醇对醇沉渣再提取，除简便易行外，另一最主要考量是此操作完全在法定的标准制法框架下、未涉及工艺改变，并能够及时将再提取液进行同批次合并进入下道工序，完全符合药品生产质量管理规范(GMP)的要求，且又不影响生产周期。

据查询SFDA(国家食品药品监督管理局)数据库，目前SFDA颁布的丹参注射液生产批文有101张，香丹注射液(复方:丹参、降香)生产批文也有165张，他们均属“老”产品，由于原研时期的研究和检测水平的限制等历史原因，在最早的1977年版中国药典(丹参注射液质量标准)及以后的各地方标准中，均无丹参有效成分含量的检测要求［22-26］。1998年国家卫生部颁布的药品标准仅增加了对原儿茶醛有效成分含量的检测［18-19］，直至2002年国家药品监督管理局颁布的“地标升国标”药品标准中的丹参类注射液或滴注液又增加了对丹参素钠有效成分含量及总酚的检测［2］。但在所有这些注射剂的标准处方中，都遵循了传统的一帖一煎中药处方模式，即均是以中药材作为注射剂的投料依据，规定了每1000 mL注射剂所需药材投入量，未及考虑中药材的采集地点、采收时间的不同，所富集的有效成分会有较大差异［27-29］，再加之提取设备型号的不同、操作人员对关键工序掌握的经验差异等，也均会对提取质量产生很大的差异。所以，虽然生产出的成品(见表2)都能符合国家质量标准的最低要求，但可控性较差，故造成企业内或企业间产品的实际质量差异很大，使得临床应用中的疗效也随之产生很大波动。系统的解决办法之一是依据现有的相对优质产品为依据，提高质量标准。二是随着研究的深入和检测水平的提高，完善质量标准。三是改变处方投料依据，减少药材提取和纯化的中间不确定性环节，即改变原中药注射剂以中药材投料控制为中药标准提取物投料控制，以保证中药注射剂或其他中药制剂产品的质量稳定、可控和临床使用疗效。而本文推荐的用相同浓度的乙醇对醇沉渣进行“洗涤”再提取被包裹的有效成分，仅是在先行质量标准的框架下，为提高丹参产品的有效成分含量，保证临床使用疗效的一种简便易行、具有较高生产应用价值的实用方法。

致谢:本实验检测工作由本公司质检科倪慧芳技师帮助完成。

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