血管紧张素Ⅱ2型受体在体可调控表达对大鼠颈动脉新生内膜增生的影响

苗 莉，罗先润，景 涛，张 辉，刘安丰，娄云霄，何国祥

0 引 言

近来研究发现AT2R对细胞的增殖、迁移具有负性影响，局部导入使其表达增强可显著减轻血管损伤后新生内膜的面积［1－2］，但导入体内基因的表达能否被实时、定量的控制在临床治疗中甚为重要。最近几年已有一系列人工控制系统出现，其中四环素可调节系统(Tet-on)具有严密开/关的基因诱导表达作用，并且高效无毒，已被成功应用于部分细胞中基因的诱导表达研究［3］。本研究在前期工作中通过引入四环素可调节系统，获得了Dox可调控表达AT2R的大鼠MSC［4］，将其作为载体导入大鼠颈动脉球囊损伤动物模型中，进一步探讨AT2R在体可调控表达对血管损伤后新生内膜的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料与动物 MSC由大鼠下肢骨髓中密度梯度离心法获得并常规培养;受Dox调控表达AT2R基因MSC由本实验室前期工作中转染、筛选获得，经RT-PCR及Western印迹杂交检测鉴定该MSC系低背景、高诱导表达AT2R基因［4］。健康成年雄性SD大鼠59只，SPF级，体重380～450 g，饲养温度18～26℃，光照为每天12 h，饲养清洁级大鼠颗粒饲养，自由取食。质量合格证号:SCXK军2002-007，由第三军医大学实验动物中心提供。DAPI(美国Roche公司);兔抗AT2R多克隆抗体(美国Santa Cruz公司);直径2.0 mm经皮冠状动脉腔内成形术球囊导管(美国Cordis公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 建立大鼠颈动脉球囊损伤模型 大鼠腹腔内注射戊巴比妥(30 mg/kg)麻醉，取颈正中切口，从颈外静脉注射肝素钠100 U/kg，从左颈外动脉切口处插入直径2.0 mm球囊导管至左颈总动脉，以1.5 atm大气压(1 atm=101.325 kPa)充盈球囊，来回抽动3次以剥脱内皮，撤出球囊及导引钢丝，用灌注管向损伤节段内注入相应的MSC悬液50μl(细胞密度:1×104/ml)或PBS，留置30 min后，再经颈动脉注射肝素钠100 U/kg，结扎颈外动脉，恢复颈总动脉至颈内动脉血流，缝合切口。

1.2.2 实验分组 SD大鼠随机分为正常组6只大鼠(未进行球囊扩张)，对照组(球囊扩张后注入PBS)、MSC组(球囊扩张后导入常规培养的MSC)、MSC转染组(球囊扩张后导入转染AT2R的MSC，未给予Dox)、Dox组(球囊扩张后导入转染AT2R的MSC，于术后当天开始至处死前3 d，每天尾静脉注射Dox 100μg/kg)，每组12只大鼠，分别于术后14、28 d处死取材，各时相点每组6只大鼠，另取5只大鼠导入DAPI荧光标记的MSC作为荧光示踪检查。

1.2.3 颈动脉新生内膜增生的检测 石蜡切片HE染色，光镜下观察血管内膜增生情况，用Image pro plus 6.0计算机图像分析系统测量内膜、中膜面积，并计算内膜/中膜面积比(I/M)。

1.2.4 荧光标记示踪 荧光标记组大鼠于术后4 d处死，取出手术的血管段及对侧未手术的颈动脉，修剪外膜，PBS反复冲洗后置入4%多聚甲醛中固定30 min，然后将血管纵向剪开，平铺在载玻片上，铺上盖玻片，在激光共聚焦显微镜下观察。

1.2.5 免疫组化分析检测AT2R 常规脱蜡至水，枸盐酸盐缓冲液95℃抗原修复30 min。封闭非特异性结合位点，加入兔抗AT2R(稀释度为1∶100)4℃孵育过夜。PBS洗5 min×3次，滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育30 min。PBS洗5 min×3次，滴加 SABC工作液，37℃孵育30 min。PBS洗5 min×3次，DAB显色，苏木精复染。脱水、透明、树胶封片。光镜下观察，用Image pro plus 6.0图像分析系统半定量分析。

1.2.6 RT-PCR 检测血管中AT2R的mRNA表达用Tripure(美国Promega公司)一步法提取组织总RNA，取10μg总RNA逆转录成cDNA，再取1μg逆转录产物进行PCR扩增。AT2R(707 bp)反应条件:94℃预变性2 min;94℃变性30 s，52℃退火1 min，72℃延伸30 s，共30个循环;72℃再延伸10 min。AT2R引物序列:正义5'-TGA TAA TCT CAA CGC AAC TGG-3'和反义 5'-TCA AGA CTT GGT CAC GGG TAA-3'。以三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH，452 bp)的PCR作为内参照。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。

2 结 果

2.1 MSC移植后在血管腔面荧光示踪结果 术后4 d，荧光标记组大鼠手术的血管段在激光共聚焦显微镜下观察，可见带有蓝色荧光的MSC生长于血管腔面，而未损伤的右侧颈总动脉内膜未见有蓝色荧光标记细胞。

2.2 计算机图像分析系统检测各组动脉内膜和中层面积 正常组大鼠颈总动脉内膜面光滑，单层内皮细胞覆盖整个管腔，无新生内膜增生;在损伤后14～28 d，对照组、MSC组、MSC转染组新生内膜增生明显，造成明显的管腔狭窄，3组间新生内膜面积无显著差异(P＞0.05);Dox组亦可见有新生内膜增生，但程度较其他各损伤组显著减轻，其I/M较对照组、MSC 组、MSC 转染组显著降低(P ＜0.01)，见表1、图1。

表1 大鼠颈总动脉新生内膜和中膜测量结果(s)Table 1 The neointima and media area in rat carotid arteries±s)

表1 大鼠颈总动脉新生内膜和中膜测量结果(s)Table 1 The neointima and media area in rat carotid arteries±s)

与对照组、MSC组和MSC转染组比，*P＜0.01

组 别 n I/M对照组 12 0.31 ±0.07 0.22 ±0.04 1.43 ±0.24 0.43 ±0.05 0 14 d内膜(mm2) 中膜(mm2)I/M28 d内膜(mm2) 中膜(mm2).24 ±0.02 1.79 ±0.29 MSC 组 12 0.32 ±0.06 0.23 ±0.04 1.39 ±0.20 0.44 ±0.04 0.24 ±0.03 1.83 ±0.18 MSC 转染组 12 0.30 ±0.07 0.21 ±0.03 1.43 ±0.21 0.41 ±0.05 0.23 ±0.03 1.77 ±0.23 Dox组 12 0.18 ±0.02 0.22 ±0.03 0.81 ±0.11* 0.25 ±0.02 0.23 ±0.02 1.08 ±0.11*

图1 大鼠颈动脉损伤后4周各组血管内膜增生情况(HE×100)Figure 1 Neointim a of the carotid arteries at 4 week after injury(HE×100)

2.3 动脉壁AT2R蛋白表达分析 免疫组化结果显示，正常组未见AT2R表达，在损伤后14 d时，对照组、MSC组、MSC转染组在动脉壁的内膜、中膜及外膜有少量AT2R表达，3组间相比AT2R的表达无明显差异(P＞0.05)，而Dox组新生内膜中 AT2R的表达显著高于其他手术组(P＜0.01);损伤后28 d时各组血管壁中AT2R的表达较14 d时均有所降低，对照组、MSC组、MSC转染组3组间相比AT2R的表达无明显差异(P＞0.05)，Dox组AT2R蛋白表达仍显著高于其他手术组(P＜0.01)，见表2。

表2 动脉壁AT2R蛋白表达的图像分析结果(A值，s)Table 2 The expression of AT2R protein in rat carotid arteries(A value，s)

表2 动脉壁AT2R蛋白表达的图像分析结果(A值，s)Table 2 The expression of AT2R protein in rat carotid arteries(A value，s)

与对照组、MSC组和MSC转染组比，*P＜0.01

时间(d)正常组(n=6)对照组(n=12)MSC组(n=12)MSC转染组(n=12)Dox组(n=12)14 0 47.62±12.11 52.22±9.08 50.76±10.42 88.20±21.39*28 0 37.12±9.50 38.78±5.76 41.50±9.98 85.67±19.88*

2.4 RT-PCR检测AT2R mRNA表达 正常组动脉壁中无AT2R mRNA的表达，在球囊损伤后14 d时，对照组、MSC组和MSC转染组均有少量表达，28 d时表达下降，3组间比较无差异(P＞0.05)，Dox组在损伤后14 d时AT2R mRNA的表达水平显著高于其他各组(P＜0.01)，28 d时仍维持较强表达(P ＜0.01)，见图2、图3。

图2 各组血管AT2R mRNA表达的比较Figure 2 Com parison of the expression of AT2R mRNA among five groups

图3 各组颈动脉AT2R m RNA表达的RT-PCR分析Figure 3 The RT-PCR analysis of AT2R mRNA in the carotid arteries

3 讨 论

对转入体内的外源基因根据治疗的需要进行相应的调控，是转基因治疗中的关键问题［5］。在临床应用中根据疾病的特点来调节转入基因的表达，使基因表达产物的浓度控制在一定的表达水平上，并带来最佳的治疗效果，是我们对转基因治疗最大的期望。在通过转基因技术使AT2R基因于血管局部表达增强，从而达到抑制新生内膜过度增殖的研究时，应考虑治疗基因如被自身启动子自发激活，使之过度表达或不适当的表达，不仅对治疗不利，还可能产生严重的后果。

经过前期2个回合的质粒转染及严格筛选，我们获得了受到Dox调控的稳定表达AT2R基因的MSC细胞系。该细胞系平时不表达AT2R基因，而给予Dox后可在48 h内显著表达，并且8周内无明显改变。本实验将该MSC系导入大鼠颈动脉损伤模型，术后4 d取注入4，6-二乙酰基-2-苯基吲哚荧光标记MSC的血管，在激光共聚焦显微镜下观察，发现在血管腔面有细胞核发蓝色荧光的细胞，表明输入的MSC于血管损伤处黏附、生长。研究发现，血管内皮损伤后14、28 d时，各手术组均出现增殖的新生内膜及AT2R的表达，其中Dox组大鼠血管内膜AT2R的表达水平显著高于对照组、MSC组及MSC转染组，并且血管内膜增生较其他3组显著减轻;MSC组、MSC转染组和对照组AT2R基因的表达情况无明显差异，3组损伤血管均可见到明显增生的新生内膜，并导致较重的管腔狭窄，3组间I/M无显著差异。该结果提示表达AT2R基因的MSC在带入局部AT2R基因的同时，AT2R基因的表达与否受到了Dox的良好调控，通过外用药物的使用使AT2R基因表达显著增高，可有效地抑制血管损伤后新生内膜的过度增生。

本实验结果还表明，MSC可能参与了球囊损伤后血管新生内膜的形成，但是对其增生程度及最终管腔面积的形成无明显影响。结合既往研究推测［6－7］，在血管内皮损伤后，MSC 可黏附于血管壁并与暴露的中膜血管平滑肌细胞接触，在局部微环境的作用下部分MSC可能向血管平滑肌细胞或内皮细胞分化，虽然可能暂时造成了血管平滑肌细胞的增多，但同时由于加速了血管内皮化的的进程对内膜的增生起到了拮抗作用，最终并不影响血管内膜的形成。该结论与2004年Wollert等［8］研究结果相一致，认为骨髓单个核细胞移植不增加介入术后再狭窄的发生率，并且与近期部分对MSC的离体或在体的研究结果相一致［9－10］。

MSC具有多向分化潜能［11－12］，以及容易通过转基因技术获得目标基因并在体内外长期表达，且取材方便，不存在组织配型及免疫排斥问题，是基因治疗中接受目标基因的优秀载体细胞［13－14］。本实验通过已建立的Dox可调控的表达AT2R的MSC为载体，首次进行了AT2R基因在体可调控表达抑制血管损伤后新生内膜形成的研究，为今后利用基因技术进行再狭窄的防治提供了新的思路及理论基础。

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