牛体外性控胚胎的移植效果观察

郑新宝,刘 宏,陈静波,蒋晓新,丁 凤,孙杰敏,于 明

(1.新疆畜牧科学院，新疆 乌鲁木齐 830000；2.新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，新疆 乌鲁木齐 830000；3.新疆哈密奥科畜牧生物科技有限责任公司，新疆 哈密 839000)

性别控制技术是通过人为干预使动物按人们所需的性别繁衍后代的技术。在畜牧业生产中有选择地繁殖理想性别的后代将大大提高畜群繁育的数量和生产性能改良的速度，从而可以节省大量的时间、精力和费用[1]。

流式细胞分类仪(Flow cytometer)利用动物X和Y精子DNA含量存在的差异，实现对X和Y精子的分离。自Johnson等(1989年)首先报道利用流式细胞分类仪成功分离出兔的X和Y精子，并用分离精子授精产下后代以来，该技术的研究取得实质性进展，已成为目前分离动物精子最可靠的方法[2]。用分离的X精子体外受精、体外培养、玻璃化冷冻等技术结合生产的性控胚胎已经进入市场。笔者在新疆哈密进行了较大规模的体外性控胚胎移植尝试，取得了较为理想的效果。

1 材料和方法

1.1 受体母牛

选择健康无病，发育良好，中等膘情，且有正常发情周期的南阳牛和新疆本地土杂种牛2 400头作为受体母牛。

1.2 体外性控胚胎

购入常规冷冻和玻璃化冷冻两种性控胚胎。

1.3 药液

解冻液、移植液、血清等；PG(氯前列醇钠)，0.2mg(2ml)/支（上海计划生育研究所生产），静松灵、利多卡因。

1.4 器械

体视显微镜、移植器、四孔培养器、培养箱。

1.5 受体牛的同期处理

用PG处理，直检一侧卵巢有功能性黄体的空怀牛，肌注剂量为0.4～0.6mg/头·次。对同期处理发情牛群和自然发情牛群，每群每天至少早晚各观察1次发情，每次至少15min以上，以接受爬跨为发情标志[3]。

1.6 常规和玻璃化冷冻体外性控胚胎的解冻

1.6.1 胚胎解冻液的准备 吸取3mL移植液，再吸取0.3mL血清，置于一次性培养皿中；取4孔板，吸取适量常规冷冻胚胎解冻液分别置于1号、2号、3号、4号孔；将培养皿、四孔板置于39℃恒温板上备用。

1.6.2 胚胎解冻方法 常规冷冻体外性控胚胎解冻方法：从液氮罐中取出胚胎细管，在空气中停留5 s，放入盛有35℃纯净水的解冻槽中，停留30 s取出。将细管两端消毒后剪开，将胚胎依次移入1号、2号、3号、4号孔中，在39℃恒温环境中各放置5min。将胚胎移入盛有移植液的培养皿中，鉴定级别，装管移植。

玻璃化冷冻体外性控胚胎的解冻方法：用镊子从液氮罐中取出细管，在装有胚胎的液段还没有离开液氮面时，用食指按住上端开口取出胚胎管，立刻将含液段的一端放入1号孔中，这时液体将自动流入1号孔中。核对1号孔中胚胎数并记录。将胚胎依次移入2号、3号、4号孔中，在39℃恒温环境中放置5min。将胚胎移入盛有移植液的培养皿中，鉴定级别，装管移植。

1.6.3 胚胎鉴定 按照胚胎等级标准将解冻后的可用胚胎分为A、B、C 3个级别，胚胎分别装管，标记和记录。

1.7 胚胎移植

以发情受体牛接受爬跨当日计为第0天，在发情第7天，检查受体牛。黄体侧卵巢基部充实、有弹性，黄体直径≥1.0 cm，可作为合格受体牛进行移植。将胚胎细管装入移植枪，套上移植外鞘、软护膜，然后采用非手术法移入受体牛有黄体侧子宫角大弯或更深部位[3]。

1.8 妊娠检查与妊娠母牛管理

移植过的受体牛单独组群集中饲养管理，在移植后50～70 d，用B超或直检对受体牛进行妊娠检查。在移植90 d以后，再次对妊娠牛进行复检，以确定最终妊娠结果。

经检查确诊妊娠的受体牛，分群单独管理，供给充足的饲草饲料以保证满足胎儿和母体的营养需求；注意采取措施防止妊娠牛之间互相顶架、挤撞、滑倒等以避免流产发生。

2 数据的统计分析

建立数据库，以移植后50～70 d的妊娠率为技术指标，用生物统计学分析法，得出结果分析。

3 结果与讨论

3.1 体外性控胚胎冷冻方法对妊娠率的影响

使用常规冷冻法胚胎移植受体牛747头次，妊娠218头，受胎率为29.2%；使用玻璃化冷冻的体外性控胚胎，移植受体牛1 454头次，妊娠510头，受胎率为35.1%，受胎率有明显提高(P＜0.01)。

表1 不同冷冻方法体外牛胚胎的妊娠结果对比

3.2 胚胎级别对妊娠率的影响

移植常规冷冻胚胎的受体牛为747头次，其中移植A级体外性控胚胎260头次，受胎率为35%；移植B级体外性控胚胎458头次，受胎率为26.8%；移植C级体外性控胚胎29头次，受胎4头。A级体外性控胚胎的受胎率比B级的有明显提高(P＜0.01)。

表2 常规冷冻法胚胎解冻后级别与妊娠结果的关系

移植玻璃化冷冻胚胎1 454头次，其中移植A级的体外性控胚胎1 013头次，受胎率37.4%；移植B级的体外性控胚胎390头次，受胎率30.0%；移植C级的体外性控胚胎51头次，受胎率27.5%。A级体外性控胚胎的受胎率比B级的有明显提高(P＜0.01)。

表3 玻璃化冷冻法胚胎解冻后级别与妊娠结果的关系

玻璃化冷冻胚胎中A级胚胎的比率大，表明玻璃化冷冻方法对胚胎的损伤程度较小。同时其A级、B级、C级胚胎的受胎率均高于常规冷冻胚胎的受胎率，表明玻璃化冷冻胚胎的质量要优于常规冷冻胚胎。质量较好的胚胎总是能获得较高的受胎率。

3.3 不同黄体鉴定方法对妊娠率的影响

利用B超仪对受体牛的黄体进行测定，并对测定结果中黄体直径≥1.0 cm的129头受体牛进行了移植，妊娠36头，受胎率为27.9%，相对于直肠检查鉴定黄体，受胎率并无明显变化。利用B超仪对受体牛的黄体进行测定的优点是比较直观，可以在图像上确定黄体的直径大小；而直检则比较方便、快捷，不仅可以大致判断黄体直径大小，而且可以根据手感判断黄体的质地和弹性，确定受体牛的黄体现状。

表4 使用不同黄体鉴定方法对移植结果的影响

3.4 体外性控胚胎产母犊率的结果

在新疆哈密累计移植体外性控胚胎2 201头次，妊娠728头次。由于时间限制，对其中357头出生犊牛的性别进行了统计，结果显示：有345头犊牛为母犊，母犊率为96.6%，性别比例效果可靠。

3.5 体外性控胚胎妊娠后流产及出生死亡情况

在移植后50～70 d，用B超对受体牛进行妊娠检查，确定有728头妊娠。在移植90 d以后，再次对妊娠牛进行复检，妊娠结果为625头妊娠，有14.1%的妊娠消失。另外，在出生的犊牛中，有一些牛出现了难产现象和犊牛早期死亡，还有个别畸形牛出生，如无肛门、腹部皮肤未愈合、后躯多出一个后肢等。

4 小结

通过以上实验及分析认为，在规模化的体外性控胚胎移植过程中，玻璃化冷冻胚胎取得了较为理想的受胎结果，胚胎质量、性控比例也有很高的水平，为此项高科技产品的推广打下了良好的基础。同时，在妊娠牛的饲养管理、犊牛接生、犊牛护理及早期培育等众多环节上，还有大量的工作要做。

[1] 卢克焕.分离精子及其在畜牧业中初步的应用[C].中国奶业协会第19次繁殖技术研讨会论文集.

[2] 余荣，杨利国.奶牛性别控制研究进展[C].中国奶业协会第19次繁殖技术研讨会论文集.

[3] 陈静波.牛冷冻精液与胚胎移植技术问答.