维持性血液透析患者外周血单个核细胞核因子κB活性与微炎症、氧化应激状态及心血管疾病的关系

徐 雁邹建洲刘中华徐少伟沈 波晋 玮滕 杰丁小强

维持性血液透析患者外周血单个核细胞核因子κB活性与微炎症、氧化应激状态及心血管疾病的关系

徐 雁1，3邹建洲2，3刘中华2徐少伟2沈 波2晋 玮2滕 杰2丁小强2

目的：探讨维持性血液透析（MHD）患者外周血单个核细胞（PBMC）核因子κB（NF-κB）活性与微炎症、氧化应激状态及心血管疾病（CVD）的关系。 方法：选取MHD治疗3个月以上的患者（32例），以体检健康者（12例）为对照组。采用ELISA法检测受试者PBMC的NF-κB活性，比色法检测血清总抗氧化能力（TAOC）及丙二醛（MDA）。Pearson相关和线性回归分析PBMC的NF-κB活性与其他指标的相关性。二分类Logistic回归分析NF-κB活性与CVD的关系。 结果：MHD患者PBMC的NF-κB活性［（1 142.4±413.0）ng/mg核蛋白vs（208.3 ±39.5）ng/mg核蛋白，P＜0.05］、血清高敏C反应蛋白（hsCRP）（3.2 mg/L vs 0.5 mg/L，P＜0.05）、TAOC［（21.9 ±6.6）U/m l vs（15.7±2.3）U/ml，P＜0.05］和MDA［（6.80±0.86）nmol/ml vs（3.89±0.51）nmol/m l，P＜0.05］皆显著高于对照组。单次HD后MHD患者PBMC的NF-κB活性显著升高［（2 076.5±690.1）ng/mg核蛋白vs（1 142.2±413.0）ng/mg核蛋白，P＜0.05］，TAOC显著降低［（13.6±5.0）U/ml vs（21.9±6.6）U/m l，P＜0.05］。Pearson相关分析显示PBMC的NF-κB活性与白细胞计数（r=0.454，P＜0.05）、血清hsCRP（r=0.590，P＜0.05）及MDA（r=0.390，P＜0.05）呈正相关。线性回归分析显示白细胞计数（β=0.338，P＜0.05）、血清hsCRP（β=0.440，P＜0.05）及MDA（β=0.319，P＜0.05）皆与PBMC的NF-κB活性独立相关。Logistic回归分析显示PBMC的NF-κB活性升高（＞1 170.0 ng/mg核蛋白）是CVD的独立危险因素（OR=8.47，P＜0.05）。 结论：MHD患者PBMC的NF-κB活性显著升高，且与微炎症、氧化应激状态及CVD相关，可作为患者的炎症标志物。

血液透析 核因子κB 炎症 氧化应激 心血管疾病

微炎症状态临床上可无明显症状，但其在维持性血液透析（maintenance hemodialysis，MHD）患者中发生率达35%～65%［1］，与氧化应激状态关系密切，互为因果。两者与患者动脉粥样硬化、贫血、营养不良、促红细胞生成素抵抗及感染等密切相关，是增加MHD患者死亡率的重要因素［2，3］。因此，寻找敏感性检测指标对早期、及时发现MHD患者微炎症状态，提高患者的生活质量和生存率有重要意义。核因子κB（NF-κB）是引发炎症反应的关键转录因子，为炎症和氧化应激状态联系的核心环节［3］。但因其检测繁琐，长期以来只用于科研［4］。近年NF-κB的ELISA检测方法的建立使其高通量定量分析成为可能，使NF-κB成为应用于临床炎症状态的敏感标志物成为可能。本文采用横断面研究，探讨MHD患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）NF-κB活性与炎症、氧化应激状态及心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的关系。

对象和方法

研究对象 2010年12月复旦大学附属中山医院血液净化中心MHD治疗患者32例，原发病包括慢性肾小球肾炎14例，糖尿病肾病9例，高血压肾损害5例，多囊肾1例，梗阻性肾病1例，其他2例原发病不明。

入选标准 MHD 3个月以上，年龄大于18岁。

排除标准 近一个月有发热等感染征象、缺血性损伤及活动性皮肤溃疡等；白细胞计数（WBC）＞10×109/L或＜4×109/L；血液系统疾病、肿瘤或恶病质等；应用静脉铁剂；近三个月内曾有以下情况：消化道出血、输血或任何原因住院，腹膜透析、肾移植转为HD者；不愿参与研究者。

透析方式 患者均应用德国Fresenius4008B/S透析机或日本日机装透析机（Nikkiso-DBB），透析器均为一次性使用，膜材料为聚砜膜，面积1.2～1.5m2。透析用水为反渗水，标准碳酸氢盐透析液，透析液流量为500 ml/min，血流量200～300 ml/min。透析处方为3次/周，4～5h/次，采用普通肝素或低分子肝素抗凝，血管通路均为自体动静脉内瘘或中心静脉置管。

健康对照组 本院体检中心健康者12例，肝功能、肾功能、血常规、尿常规、心电图、胸片、腹部彩色超声波检查正常，无肥胖、吸烟史等。

本研究经本院医学伦理委员会批准，所有受试对象均签署知情同意书。

方法

临床资料 包括年龄、性别、促红细胞生成素用量及透析相关资料等。体质量指数（BMI）=体重（kg）/［身高（m）］2。用单室尿素清除指数（spKt/V）评价透析充分性。

实验室检查 常规方法检测血红蛋白、WBC、血清肌酐、血尿素氮、钙、磷、白蛋白、前白蛋白、三酰甘油、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和高敏C反应蛋白（hsCRP）。

PBMC的NF-κB活性测定 MHD患者于周中短周期透析的透析前空腹及透析结束前10 min抽血，对照组晨起空腹抽血10 ml，置肝素抗凝管。取血后2h内采用密度梯度离心法分离人PBMC，提取PBMC的核蛋白。采用ELISA法检测核蛋白NF-κB活性，根据ELISA试剂盒（上海蓝基生物公司，产品号E01N0011）说明书操作。

氧化应激指标测定 血清管采集MHD患者周中短周期透析前空腹及透析结束前10 min静脉血，对照组晨起空腹外周静脉血2 ml，4℃离心后取血清，采用可见光分光光度法（机体中许多抗氧化物质，能使Fe3+还原成Fe2+，后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物，通过比色可测出其抗氧化能力的高低。）测定总抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAOC），试剂盒（货号A015）购自南京建成生物工程研究所。硫代巴比妥酸（TBA）反应法测定丙二醛（malondialdehyde，MDA），试剂盒（货号A003-1）购自南京建成生物工程研究所，严格按照说明书操作。

统计学分析 用SPSS17.0软件进行数据统计分析。连续性变量先行正态性检验。正态分布的连续变量采用±s表示；偏态分布的连续变量采用中位数（四分位数间距）表示。用多个独立样本非参数检验、两相关样本非参数检验、两独立样本非参数检验、单因素方差分析、配对样本t检验、χ2检验比较组间差异。Pearson相关和线性回归分析NF-κB活性与各指标之间的相关性。二分类Logistic回归分析NF-κB活性与CVD的关系。所有P值均为双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。所有可信区间为95%。

结 果

一般资料 MHD组男18例，女14例，年龄61.0岁（52.5～71.0岁）；健康对照组男7例，女5例，年龄60岁（51～70）岁。两组的性别构成和年龄差异无统计学意义。MHD组共19例（59.4%）患者合并CVD，其中心肌梗死3例（15.8%），心绞痛4例（21.1%），心力衰竭4例（21.1%），脑梗死5例（26.3%），脑出血2例（10.5%），外周血管病1例（5.3%）。

PBMC的NF-κB活性、血清hsCRP及氧化应激指标 MHD患者透析前PBMC的NF-κB活性、血清hsCRP、TAOC及MDA均显著高于健康对照组（P＜0.05）。单次透析后PBMC的NF-κB活性显著高于透析前，hsCRP较透析前略有升高，但差异无统计学意义，TAOC显著降低，MDA较透析前无明显变化（表1）。

表1 PBMC的核因子κB活性、血清hsCRP及氧化应激指标比较

PBMC的NF-κB活性相关因素分析 MHD患者血清hsCRP中位数为3.2 mg/L（1.1～8.9 mg/L），其中17例（53.1%）患者血清hsCRP升高（＞3 mg/L）。Pearson相关分析显示PBMC的NF-κB活性与WBC、血清hsCRP及MDA呈正相关（hsCRP行自然对数转换）（表2）。校正了年龄、性别、血管通路后PBMC的NF-κB活性仍与WBC（r= 0.414，P＜0.05）、hsCRP（r=0.389，P＜0.05）及MDA（r=0.356，P＜0.05）呈正相关。线性回归分析显示WBC、血清hsCRP及MDA皆与PBMC的NF-κB活性独立相关（表3）。

MHD患者PBMC的NF-κB活性与CVD的相关性分析 合并CVD患者PBMC的NF-κB活性显著高于非CVD患者［（1 308.8±413.0）ng/mg核蛋白vs（899.1±277.2）ng/mg核蛋白，P＜0.05］。Logistic回归分析结果显示PBMC的NF-κB活性升高（＞1 170.0 ng/mg核蛋白）、年龄增长及前白蛋白降低（＜0.34 g/L）为CVD的独立危险因素（将CVD与非CVD患者中有差异的变量以中位数为界分为两组引入Logistic回归方程）（表4）。

讨 论

NF-κB是细胞中一个重要的转录调节因子，静息状态下与κB抑制因子（IκB）相结合形成复合体，以无活性状态存在于胞质中。当细胞受到外界刺激时，IκB激酶复合体活化将IκB磷酸化，使NF-κB暴露核定位位点。游离的NF-κB迅速移至细胞核，与特异性κB序列结合，诱导相关基因转录。在炎性病变中，激活NF-κB的因素主要有细胞因子（TNF-α、白细胞介素1β）、内毒素及氧化应激等。不同的刺激因素可以通过不同的信号转导通路激活NF-κB，其中最重要的是依赖IκB丝氨酸磷酸化的经典途径。该信号途径反应十分迅速，实验证实5 min左右即可使NF-κB的活性水平达到峰值，且广泛存在［5-7］。大量研究已经证实NF-κB为炎症事件的敏感标志物，但因其检测繁琐，较少应用于临床［4，7，8］。近年来随着NF-κB的ELISA检测方法的建立，使其高通量测定成为可能［4，9］。

表2 MHD患者PBMC的NF-κB活性及血清hsCRP与临床及实验室指标相关性的单变量分析

表3 MHD患者PBMC的NF-κB活性与其他指标相关性的线性回归分析

表4 MHD患者CVD危险因素的二分类Logistic回归分析

本研究结果显示，MHD患者PBMC的NF-κB活性明显高于健康对照组，超过半数的MHD患者血清hsCRP升高，说明MHD患者体内普遍存在微炎症状态。同时，单次透析后PBMC的NF-κB活性明显高于透析前，提示HD过程可激活NF-κB，诱发炎症反应，也证实了NF-κB信号通路反应迅速，表明NF-κB活化可以更早期提示炎症反应。与以往的研究结果相符［3，7，8］。C反应蛋白是反映体内炎症状态公认的可靠标志物，本研究结果提示MHD患者PBMC的NF-κB活性与WBC及hsCRP呈正相关，说明其可以很好地反映MHD患者的炎症状态。

MHD患者体内普遍存在较高水平的氧化应激状态，与氧自由基清除系统的严重损伤使体内活性氧（reactive oxygen species，ROS）升高，氧化和抗氧化系统失衡有关［10］。氧化应激通过NF-κB、激活蛋白1途径激活单核细胞的炎症基因启动子，随后相关mRNA激活转录产生炎症因子。反之炎症因子通过白细胞膜上的还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧化酶复合物的氧化作用产生ROS放大氧化应激反应，从而进一步刺激炎症细胞的激活，因此氧化应激和炎症反应之间形成螺旋上升的恶性循环［3］。正常状态下，机体存在完善的抗氧化机制，通过无酶途径（如维生素E、维生素C、类胡萝卜素及硒等）和有酶途径（如过氧化氢酶、过氧化物歧化酶及谷胱甘肽过氧化物酶）清除ROS，起到抗氧化作用。我们测定的TAOC包括无酶和有酶途径。MDA是体内超氧阴离子攻击生物膜中的多价不饱和脂肪酸引发过氧化作用的毒性最终产物，是经典的、最有代表意义的脂质氧化标志物［10］。

本研究发现MHD患者透析前MDA水平显著高于对照组，说明MHD患者体内普遍存在氧化应激状态。常规HD过程诱发氧化应激的潜在因素有：（1）透析膜生物不相容性是产生ROS的主要原因；（2）透析液中微生物和内毒素污染；（3）MHD中丢失水溶性小分子物质（如维生素C）、微量元素（如硒）和酶调节复合物，损伤抗氧化系统；（4）红细胞通过血泵时的机械损伤所致微量溶血也有一定影响；（5）应用静脉铁剂和促红细胞生成素等药物，加重患者的氧化应激状态；（6）终末期肾病患者由于厌食、高血钾限制新鲜蔬菜水果的摄入等原因造成维生素C等抗氧化维生素摄入不足［11］。我们的研究发现，MHD患者透析前抗氧化指标TAOC明显高于对照组，与国外一些学者的研究结果相似［12，13］。

MHD患者TAOC升高的原因考虑与以下因素有关：（1）患者TAOC升高是体内ROS产生增多的代偿机制；（2）肾衰竭患者体内的代谢产物如尿酸、胆红素等影响了抗氧化能力的检测结果。患者单次透析后TAOC明显降低，验证了透析过程能消耗、丢失维生素C和硒等水溶性抗氧化物质，此外还与透析后尿酸降低有关。本研究发现MHD患者PBMC的NF-κB活性与hsCRP及MDA独立相关，进一步支持炎症与氧化应激状态之间密切相关，NF-κB为炎症和氧化应激状态联系的核心环节。而我们的研究中hsCRP与MDA无相关性，仅提示两者有相对独立的病理过程，不能根据hsCRP水平判断氧化应激的程度［14］。

血清白蛋白为公认的营养指标，本研究显示，hsCRP与白蛋白呈负相关，提示微炎症状态可加重营养不良，NF-κB活性和hsCRP与BMI、前白蛋白及血脂等无相关性，可能与我们排除了中重度炎症和营养不良的患者，Ⅱ型营养不良的患者较少及样本量相对较小有关。目前认为动脉粥样硬化本身是一种炎症性疾病，免疫反应造成的血管损伤是动脉粥样硬化发生的中心环节。NF-κB是引起炎症反应的关键转录因子，在炎症反应中起重要作用。分子水平的研究发现，动脉粥样硬化炎症病变过程中炎性细胞的激活和炎性因子的释放与NF-κB的激活密切相关［15］。本研究显示MHD患者PBMC的NF-κB活性升高是CVD的独立危险因素，NF-κB＞1170.0 ng/mg核蛋白，发生CVD的风险升高8.47倍。但因检测方法较新，相关研究甚少，尤其在MHD患者尚无相关报道。因此，结果的稳定性尚需进一步的研究验证。此外，本研究还发现前白蛋白降低和高龄也是CVD的独立危险因素，验证了传统和非传统危险因素在MHD患者CVD的发病中皆有重要作用。

总之，MHD患者PBMC的NF-κB活性与炎症、氧化应激状态及CVD密切相关，可成为应用于临床的炎症状态敏感标志物。由于本研究样本量较小，且为横断面研究，结果的可靠性还有待大样本研究证实。

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NF-κB activity of peripheral blood mononuclear cell，m icroinflammation，oxidative stress and cardiovascular disease in hemodialysis patients

XU Yan1，3，ZOU Jian-zhou2，3，LIU Zhong-hua2，XU Shao-wei2，SHEN Bo2，JINWei2，TENG Jie2，DING Xiao-qiang21Department of Nephrology，Shanghai Tongji Hospital，Shanghai200065，China
2Department of Nephrology，Zhongshan Hospital，Fudan University，Shanghai200032，China
3XU Yan and ZOU Jian-zhou are considered to be first authors

DINGXiao-qiang（E-mail：dxq93216@medmail.com.cn）

Objective：The aim of the study was tomeasure nuclear factor kappa B（NF-κB）activity of peripheral blood mononuclear cell（PBMC）and evaluate the correlation of NF-κB activity andmicroinflammation，oxidative stress and cardiovascular disease in patients with maintenance hemodialysis（MHD）. M ethodology：The peripheral blood was obtained from thirty two patients with MHD before and after undergoing hemodialysis and 12 age-matched healthy subjects regarded as control.Nuclear extracts NF-κB activity of PBMC was measured by enzyme-linked immunosorbant assay（ELISA）and serum total antioxidant capacity（TAOC）and malondialdehyde（MDA）was measured by colorimetry. Pearson correlation and linear regression were used to assess the relationship between NF-κB activity and other laboratory parameters.Binary logistic regression was used to assess the correlation of NF-κB activity and CVD in MHD patients. Results：NF-κB activity of PBMC［（1 142±413）ng/mg nuclear extracts vs（2 083±39.5）ng/mg nuclear extracts，P＜0.05］，serum hsCRP（3.2 mg/L vs 0.5 mg/L，P＜0.05），TAOC［（21.9±6.6）U/ml vs（15.7±2.3）U/m l，P＜0.05］and MDA［（6.80±0.86）nmol/m l vs（3.89±0.51）nmol/m l，P＜0.05］were significantly higher in MHD patients compared with controls.After a single HD session，NF-κB activity of PBMC was increased acutely［post-HD（2 077±690）ng/mg nuclear extracts vs pre-HD（1 142±413）ng/mg nuclear extracts，P＜0.05］and T-AOC was decreased significantly（13.6±5.0 U/m l vs 21.9±6.6 U/ml，P＜0.05）.In all MHD patients，NF-κB activity was correlated positively with white blood cell count（r=0.454，P＜0.05），hsCRP（r=0.590，P＜0.05）and MDA（r=0.390，P＜0.05）.Linear regression analysis showed white blood cell count（β=0.338，P＜0.05），hsCRP（β=0.440，P＜0.05）and MDA（β=0.319，P＜0.05）were independently associated with NF-κB activity.High NF-κB activity（＞1 170 ng/mg nuclear extracts）was positively and independently associated with CVD（OR=8.47，P＜0.05）. Conclusion：NF-κB activity of PBMC ismarkedly elevated in MHD patients，which is associated with microinflammation，oxidative stress and cardiovascular disease and can be a usefulmarker of inflammation in patients with MHD.

hemodialysis nuclear factor kappa B inflammation oxidative stress cardiovascular disease

2011-05-31

（本文编辑 律 舟 春 江 书 实）

上海市重大项目（08DZ1900602）；教育部国家“211工程”重点学科建设项目（三期）（211XK20）

1上海市同济医院肾内科（上海，200065）；2复旦大学附属中山医院肾内科血液净化中心；3共为第一作者

丁小强（E-mail：dxq93216@medmail.com.cn）

©2011年版权归《肾脏病与透析肾移植杂志》编辑部所有