木聚糖酶产生菌的筛选鉴定及木聚糖酶基因（Xyn B）的克隆

广西人口和计划生育研究中心 莫 毅梁方方＊ 赖志强 卢玉发 廖玉英

广 西 畜 牧 研 究 所 何仁春 黄丽霞

华南农业大学动物科学学院 杨 琳

木聚糖是一种由β-1，4-木糖苷键连接形成并带有多种取代基的多聚糖，主要存在于植物细胞壁中，在自然界中是除纤维素之外第二丰富的可再生物质资源（Prade，1995）。植物性饲料中含有大量木聚糖，它们在动物消化道内，不易被消化酶消化，从而增加了动物消化道内的食糜黏性，降低饲料消化率和营养的吸收（张晓晖等，2007）。微生物木聚糖酶能水解木聚糖生成长度各异的木寡糖，对半纤维素降解起着关键作用，其中以内切方式降解木聚糖分子中1，4-β-D木糖苷键的O-糖苷水解酶（O-glycoside hydrolases）为主，其水解产物主要为木糖、木二糖及木三糖等低聚木糖，还有少量阿拉伯糖（徐君飞等，2007）。研究表明，木聚糖酶可改善消化道功能、增强免疫力、提高饲料利用率和生产性能、减少粪便对环境的污染（杨会涛等，2007）。

为了获得酶活性较高的木聚糖酶产生菌，本试验从长期堆放青贮饲料堆下土壤中取样，并通过木聚糖富集培养基和筛选培养基分级筛选出一株产木聚糖酶活性较高的菌株，对其进行了细菌形态学鉴定、16 S rRNA PCR扩增鉴定；而后使用Oligo 6.44生物软件，根据上述鉴定结果，以Genebank中公布的木聚糖酶Xyn B基因序列为模板，设计特异引物扩增其Xyn B基因，为日后木聚糖酶Xyn B基因的重组高效表达和在动物饲料添加剂中应用提供材料。

1 材料与方法

1.1 土样 土壤样品取自广西畜牧研究所黄牛室长期堆放青贮饲料堆下，采集富含腐败木质纤维材料的土壤样品若干份。采集时用小铲子除去表土后离地面5～15 cm处取样，盛于事先灭菌带塞子的试管中。

1.2 酶和主要试剂 Taq DNA聚合酶，dNTPs和DNA分子量标准购自TaKaRa公司，木聚糖购自Sigma公司，其他常规试剂为国产分析纯。

1.3 培养基

1.3.1 富集培养基（g/L）木聚糖 10，蛋白胨 5，氯化钠 5，pH自然，121℃灭菌20 min（陈勇等，2009）。

1.3.2 平板筛选培养基（g/L）木聚糖10，硝酸钾l，硫酸镁 0.2，氯化钠 0.5，磷酸氢二钾 0.5，琼脂20，pH 自然，121 ℃灭菌 20 min（陈勇等，2009）。

1.3.3 斜面培养基（g/L）木聚糖8，酵母膏5，硫酸镁0.2，氯化钠0.5，磷酸氢二钾0.5，硫酸锰0.005，琼脂 20。pH 自然，121℃灭菌 20 min（陈勇等，2009）。

1.4 方法 采取土样→无菌水浸提 （取上清液）→富集培养→取上清液涂布平板筛选培养基→分离纯化→透明圈大的菌株为优良菌株→16S rRNA鉴定→木聚糖酶XynB基因克隆。

1.5 菌种的富集、分离、筛选和纯化 称取1 g土壤样品放入l00 mL无菌PBS的三角瓶中，放入摇床，37℃，200 r/min振荡，将土样摇散后培养1 h。取出静置，按无菌操作要求取1 mL上清液接入富集培养基中，37℃，200 r/min振荡培养24 h。将经过富集的菌液取出离心，依次稀释成10-6，10-7，10-8倍，取菌液0.2 mL涂布于平板筛选培养基上，放入37℃恒温培养箱，倒置培养48 h。挑选透明圈较大的单菌落，转接到新鲜的分离平板进行反复纯化。配制斜面培养基，将纯化的菌种接种到斜面培养基上，测量透明圈的直径，所有数据是重复3次的平均值。然后，选定透明圈最大且透明的菌株作为后续试验的基础菌。

1.6 菌种形态学特征鉴定 参照Dong和Cai（2001）通过革兰氏染色，显微镜观察菌体形态。

1.7 16S rRNA鉴定 本试验采用细菌16S rRNA通用引物进行PCR扩增，引物序列如下（由上海生工生物工程技术服务有限公司合成）：

16SrRNAF：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇

16SrRNAR：5＇-GGTTACCTIGTTACGACTT-3＇

挑取少许培养24 h的斜面菌种，加入1.0 mL无菌水中制成菌悬液，作为PCR反应的模板，PTC-200 PCR仪（美国MJ公司）进行PCR扩增。PCR 反应体系为 50 μL， 含有模板 2.0 μL，10 mmol/L 正 反 引 物 各 1.5 μL，10 mmol/L dNTPs 1.5 μL，10×Reactions Buffer 5.0 μL，2 U rTaq 酶，ddH2O补足 50 μL。反应条件：95℃预变性 5 min，94℃变性 45 s，53.5℃退火 50 s，72℃延伸90 s，34个循环；72℃后延伸 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测见图1，并送于上海鼎安生物工程技术服务有限公司进行测序。将所得测序结果通过Blast程序与Genebank中核酸数据进行比对分析（Naveen等，2000）。

1.8 木聚糖酶Xyn B基因克隆 根据形态学特征和16S rRNA鉴定结果，从Genebank中调取枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis strain）的木聚糖酶Xyn B基因的cDNA序列，并以此为模板，使用Oligo 6.44软件设计其特异引物，引物序列如下：

Xyn B F：5＇ -GAATTCCATCATATGTTTAAGTTTAAAAAGAAT-3＇

XynB R：5＇-TCTAGATGATGCCACACTGTTTTAGAAC-3＇（删除TAA终止子密码）

使用与16s rRNA类似的PCR程序，只是退火温度改为45℃，进行木聚糖酶Xyn B基因的扩增见图1。PCR产物经纯化后，回收片段与pUC18-T vector连接过夜后，连接反应液转化E coli DH5α（曾静等，2002）；在含氨苄青霉素的 LB选择培养基中，挑取白色菌落，筛选阳性克隆，经PCR检测后，送于上海鼎安生物工程技术服务有限公司进行测序。将所得序列通过Blast程序与Genbank中核酸数据进行比对分析 （Naveen等，2000）。

2 结果分析和讨论

2.1 木聚糖酶高产菌株的筛选 将采集的土壤经富集培养及大量平板划线培养分离，得到比较单一的菌落，此过程得到7株较纯菌株。将这些菌株分别接种到斜面培养基，每株点3个重复，37℃培养后测量透明圈的直径，所有数据是重复3次的平均值。分离到的7株菌的形态特征，及其透明圈测量结果见表1。根据透明圈的大小在一定程度上反应了菌株产酶能力的强弱。挑选其中透明圈较大且透明的菌株转接于斜面培养基，并用封口膜封存置于4℃冰箱内保存。选择产生透明圈最大的菌株X7，作为后续试验的基础菌。

表1 木聚糖酶产生菌株的形态特征及透明圈测量结果

2.2 菌株形态特征鉴定 菌株X7革兰氏染色反应为阳性；呈杆状，无荚膜，周生鞭毛；形成芽孢，呈椭圆到柱形，芽孢生长时菌体会稍微增大；在斜面培养基平板上生长较快，呈淡黄色菌落，表面粗糙不透明。

2.3 16S rRNA序列分析鉴定 使用16S rRNA通用引物从菌株基因组中扩增出约1.5 kb的目的片段，PCR产物交由上海鼎安生物工程技术服务有限公司进行测序，测序结果与GeneBank中的序列进行比对，结果表明，菌株X7与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis strain GD3b，Genebank 编码HM055602.1）同源性最高为98.5%，与枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）库中其他记录的16S rRNA均有90%以上的同源性。结合菌株形态特征鉴定和16S rRNA序列分析鉴定，故该菌株X7应隶属于枯草芽孢杆菌属。

2.4 木聚糖酶Xyn B基因克隆及序列分析 使用枯草芽孢杆菌Xyn B基因特异引物从菌株X7基因组中扩增出约0.6 kb的目的片段，PCR产物经琼脂糖凝胶纯化后，与pUC18-T vector连接获得阳性克隆pUC-Xyn B，挑选阳性克隆交由上海鼎安生物工程技术服务有限公司进行测序，测序结果使用GeneBank中Blast程序进行序列比对，结果表明：pUC-Xyn B测序结果与GeneBank中公布枯草芽孢杆菌的Xyn B基因序列同源性为99.0%，克隆子484位和499位核苷酸碱基发生突变，分别为（A）CG-（T）CG，AC（T）-AC（C）；相应的氨基酸突变前者为错义突变T-S，后者为同义突变T-T。

3 结论

本研究中成功筛选到了7株木聚糖酶产生菌，并选取透明圈最大的木聚糖酶产生菌X7作为基础菌，对其进行16 s rRNA部分序列PCR扩增测定，经BLAST同源性分析确定X7为枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis strain GD3b（Genebank 编码：HM055602.1）。然后，从 GeneBank中获取枯草芽孢杆菌Xyn B基因序列，设计特异引物从X7菌株中克隆相应的目的基因。为日后构建木聚糖酶Xyn B基因酵母表达载体，培育能够分泌表达具有高活性的木聚糖酶酵母工程菌奠定了基础。

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