HPLC法测定莲须中木犀草素的含量

李彦博，孙 静

莲须为睡莲科植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)的干燥雄蕊。味甘、涩，性平，归心、肾经，具有固肾涩精之功效。主要成分为木犀草素、槲皮素、异槲皮苷、山柰素等黄酮类化合物［1］。《中国药典》［2］仅收载显微鉴别，无含量测定标准。本文首次采用HPLC法建立莲须中木犀草素的含量测定方法，为控制莲须药材的质量提供实验依据。

1 仪器与试药

Waters Alliance 2695高效液相色谱仪，Waters二极管阵列检测器(PDA 2996)，Waters Empower色谱工作站，UV-2401PC紫外分光光度计(日本岛津)，sartorius电子天平。木犀草素对照品购自中国药品生物制品检定所(批号:111520-200504);甲醇为色谱纯;水为纯净水;其余试剂均为分析纯。莲须样品经山东中医药大学石俊英教授鉴定为睡莲科植物莲的干燥雄蕊。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Phenomenex-C18(4.6mm ×250mm，5μm);流动相:甲醇-0.2%磷酸溶液(55∶45);检测波长:350 nm;PDA色谱峰光谱采集范围:300～400 nm;流速:1.0mL/min;柱温:30℃;进样量:20μL;理论塔板数按木犀草素峰计算应不低于2500。

2.2 检测波长的选择 取木犀草素对照品适量，用甲醇溶解，照紫外-可见分光光度法，在200～400 nm之间扫描，木犀草素在350 nm处有最大吸收，且峰形良好，故确定检测波长为350 nm。

2.3 供试品溶液色谱峰纯度检查 由于中药材无法制备阴性对照溶液，故选用二极管阵列检测器对供试品溶液色谱峰纯度进行检查。实验结果显示，供试品溶液与对照品溶液在木犀草素保留时间处的光谱图完全一致，表明供试品溶液在木犀草素保留时间处无其他干扰杂质。

2.4 线性关系考察 精密称取木犀草素对照品(五氧化二磷干燥器中减压干燥48 h)10.2 mg，用甲醇溶解并定容至100mL，作为木犀草素对照品储备液(浓度为0.102 mg/mL)。分别精密量取木犀草素对照品储备液 1、2、4、8、10mL，用甲醇溶解并定容至10mL，作为5个浓度的木犀草素对照品溶液。分别精密吸取20μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以木犀草素进样量C为横坐标、吸收峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程:A=3744608 C-34106(r=0.9997)。表明木犀草素在 0.204μg～ 2.040μg之间与吸收峰面积呈良好线性关系。

2.5 精密度实验 取同一木犀草素对照品溶液(浓度为0.0408 mg/mL)，在上述色谱条件下，连续进样5次，测定，吸收峰面积分别为3054041、3033706、3053315、3046547、3020652，平均为3041652，RSD=0.47%。表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性实验 取同一供试品溶液，分别于制备0、1、2、4、6 h 后测定，吸收峰面积分别为1829629、1825177、1818354、1812158、1806-626，平均为1818389，RSD=0.51%。表明供试品溶液在制备后6 h内基本稳定。

2.7 重复性实验 取同一样品，平行制备5份供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算含量，结果分别为 0.0419%、0.0422%、0.0415%、0.0421%、0.0417%，平均为0.0419%，RSD=0.68%。表明方法的重现性良好。

2.8 加样回收率实验 精密称取已知含量(0.0423%)的样品6份，分别精密加入一定量木犀草素对照品，按样品测定方法处理，测定，计算加样回收率，结果见表1。木犀草素的平均加样回收率为99.44%，RSD=0.82%。表明测定方法准确、可靠。

表1 木犀草素含量测定加样回收率实验结果(n=6)

2.9 样品测定 取样品粉末2 g，精密称定，精密加入甲醇50mL，称定重量，回流提取2 h，放冷，用甲醇补足损失的重量，滤过，取续滤液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，结果见图1、表2。

图1 木犀草素含量测定高效液相色谱图

表2 莲须中木犀草素含量测定结果(n=3)

3 讨论

3.1 实验过程中，笔者从提取方法、提取溶媒、提取时间3个方面对供试品溶液的制备方法进行了优化筛选。实验结果表明，回流提取的效率高于超声提取，以甲醇为溶媒提取效果优于乙醇;分别以1 h、2 h、3 h为提取时间的研究结果显示，2 h木犀草素溶出即达到平衡，2 h以后，延长提取时间，测得木犀草素含量不再增加，故确定供试品溶液的制备方法为甲醇回流提取2 h。

3.2 实验结果表明，不同产地的莲须样品中木犀草素含量有一定差异。其中浙江杭州产的莲须木犀草素含量最高，达0.0844%;河北保定产的莲须木犀草素含量最低，为0.0404%。前者高出后者一倍多。

3.3 HPLC法测定莲须中木犀草素的含量，操作简便、准确，重现性好，加样回收率高，可以用于莲须的质量控制，填补《中国药典》莲须项下无含量测定的空白。

［1］南京中医药大学.中药大辞典.下册［M］.上海:上海科学技术出版社，2006:2501.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:257.