高危型HPV病毒载量结合分型检测在宫颈癌中的应用价值

张 蓉，侯文静，喻 康，邬美玉*

(1上海市奉贤区中心医院，上海201400;2江苏省常州妇幼保健院)

近年研究发现，约90%以上的宫颈癌组织中可检测到人乳头状瘤病毒(HPV)DNA，其中高危型HPV约占60%［1］，高危型HPV感染与宫颈癌的发生密切相关。因此，国内外妇产科专家建议对30岁及以上妇女进行HPV DNA检测及细胞学联合的子宫颈筛查［2］，以尽早发现宫颈癌的发生。本研究对66例宫颈癌患者宫颈脱落细胞采用第二代杂交捕获技术(HCⅡ)和HybriMax技术对HPV DNA进行病毒载量和分型检测，以探讨高危型HPV DNA与宫颈癌生物学行为的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2007年10月～2011年3月在常州妇保院及我院就诊，经病理学诊断确诊为宫颈癌患者66例，年龄23～63岁，其中鳞癌65例，腺癌1例;Ⅰ期38例，Ⅱ期28例;病理分级1级8例，2级55例，3级3例;33例已侵入宫颈间质。并对其中25例患者进行长期随访，术后复查高危型HPV DNA病毒载量和病毒分型。随访时间1个月～9 a。

1.2 仪器与试剂 HCⅡ基因杂交信号扩大仪(DML2000)及配套HPV DNA检测试剂盒、宫颈细胞采样器购自美国DIGENE公司，HybriMax医用核酸分子快速杂交仪及配套HPV DNA检测试剂盒购自香港凯普公司。

1.3 标本采集 采用配套宫颈采样器插入患者阴道，与宫颈口顺时针旋转3～5圈，避免宫颈分泌物及血液污染，立即浸入含保护剂的专用试管，封盖后送至实验室4℃冰箱保存，2周内检测。

1.4 HPV DNA病毒载量检测 采用HCⅡ对患者宫颈脱落细胞HPV DNA载量进行检测，共检测16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68 等 13 种高危型HPV。由实验技术人员严格按试剂盒说明书，经裂解—杂交—捕获—信号放大—分析实验步骤进行操作，在DML2000荧光检测仪上读取相对光学单位(RLU)。当 RLU/阳性对照 RLU＞1.0时表示HPV DNA阳性。

1.5 HPV DNA病毒分型检测 采用HybriMax技术对患者宫颈脱落细胞HPV DNA进行分型检测，检测21种亚型，其中15种高危型为:16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68，还包括 6 种低危亚型:6、11、42、43、44 和 HPVcp8340。

1.6 统计学方法 应用SPSS13.0进行统计分析。采用χ2检验、秩和检验比较各组间差异。以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 高危型HPV DNA阳性率及病毒载量与宫颈癌生物学行为相关性 见表1。本研究宫颈癌患者高危型HPV DNA阳性率达94%(62/66)。宫颈癌患者各临床分期、病理分级间高危型HPV感染率无明显差异(P＞0.05)，但病毒DNA载量临床分期Ⅱ期明显低于Ⅰ期，病理分级2级、3级高于1级(P＜0.05)，且发生宫颈间质侵入的宫颈癌患者高危型HPV感染率及病毒DNA载量均上升(P＜0.05)。

表1 高危型HPV DNA阳性率及病毒载量与宫颈癌生物学行为相关性

2.2 高危型HPV DNA病毒分型与宫颈癌生物学行为相关性 见表2。本研究宫颈癌患者单一感染11例，多重感染55例，HPV16与HPV18有单一感染和多重感染两种感染方式;而HPV33与HPV58则只见于多重感染。各临床分期、病理分级及是否侵入间质中，多重感染率明显高于单一感染率，并且多重感染率与临床分期、病理分级、是否侵入宫颈间质有关(P ＜0.05)。

表2 高危型HPV DNA病毒分型与宫颈癌生物学行为相关性［例(%)］

2.3 术后随访 手术治疗后随访宫颈癌患者25例，其中术前HPV DNA阳性24例(96%)，术后半年内阴性20例(80%)，术后10个月开始转阴1例(4%)，持续阳性4例(16%)。术前病毒DNA载量中位数和四分位间距分别为46.31、147.34 pg/ml，术后分别为 0.50、1.23 pg/ml，手术前后有统计学差异(P＜0.05)。术前多重感染率76%(19/25)，术后6个月内为8%(2/25)，P ＜0.05。

3 讨论

高危型HPV持续感染是宫颈癌及其癌前病变发生的必要条件［3，4］，这一观点已得到国内外妇产科学者的共识。检测高危型HPV DNA可从病因学水平筛选已发生或即将发生的宫颈癌病变。近年来，国内外妇产科医师开始采用分子生物学技术进行高危型HPV DNA的筛查，HCⅡ是其中发展迅速的一种简便可靠的技术。我们应用该技术对我院妇科疾病门诊患者进行筛查，发现宫颈癌患者高危型HPV阳性率高达94%，与文献报道的100%相比略低［5］，可能原因:①HCⅡ技术杂交探针仅包括13种高危亚型，某些其他高危型别未包括在内;②宫颈癌组织细胞缺氧造成的坏死有可能引起高危型HPV DNA的丢失;③妇科医生宫颈取样方法之间的差异有可能影响到样本中宫颈脱落细胞数量，导致HCⅡ检测结果受一定的影响。

高危亚型HPV的持续性或反复感染已被确定为宫颈癌发生的最主要原因，由于不同亚型HPV其编码外壳蛋白的基因变异很大，不同亚型HPV之间基本上没有交叉保护抗体，容易造成不同高危型HPV多重感染或者交叉感染。Lee等［6］研究发现，单一HPV感染使宫颈癌的患病风险增加19.9倍，而多重HPV感染使该风险增加到31.8倍。我们的研究表明，在宫颈癌临床不同分期与病理不同分级中，多重感染率明显高于单一感染率，并且与不同分期、分级、是否侵入宫颈间质有关，故对HPV DNA基因分型的检测在宫颈癌的早期诊断和防治具有深远的意义。

Meta分析显示，高危型HPV检测是最好的子宫颈锥切后CIN复发或持续存在的预测因子［7］。本研究随访发现，96%宫颈癌患者高危型HPV DNA阳性，80%术后半年转为阴性，但4例患者术后持续阳性，目前随访资料显示，4例术后治疗效果良好，但他们是否有较高的复发率，仍在进一步的随访之中。

［1］Schiffman M，Castle PE，Jeronimo J，et al.Human papillomavirus and cervical cancer［J］.Lancet，2007，370(9590):890-907.

［2］Chen YY，You SL，Chen CA，et al.Effectiveness of national cervical cancer screening programme in Taiwan:12-year experiences［J］.Br J Cancer，2009，101(1):174-177.

［3］Castle PE，Rodríguez AC，Burk RD，et al.Long-term persistence of prevalently detected human papillomavirus infections in the absence of detectable cervical precancer and cancer［J］.J Infect Dis，2011，203(6):814-822.

［4］Schiffman M，Wentzensen N，Wacholder S，et al.Human papillomavirus testing in the prevention of cervical cancer［J］.J Natl Cancer Inst，2011，103(5):368-383.

［5］Saini R，Shen TH，Othman NH，et al.Evaluation of polymerase chain reaction(PCR)method and hybrid capture II(HCII)assay for the detection of human papillomavirus in cervical scrapings［J］.Med J Malaysia，2007，62(3):206-209.

［6］Lee SA，Kang D，Seo SS，et al.Multiple HPV infection in cervical cancer screened by HPV DNA chip ［J］.Cancer Lett，2003，198(2):187-192.

［7］Frega A，Biamonti A，Maranghi L，et al.Follow-up of high-grade squamous intra-epithelial lesions(H-SIls)in human immunodeficiency virus(HIV)-positive and human papillomavirus(HPV)-positive women.analysis of risk factors［J］.Anticancer Res，2006，26(4B):3167-3170.