高同型半胱氨酸血症诱导eNOS脱偶联损害冠状动脉内皮功能

王 莹，何立芸，毛节明，王 广*

(1北京市海淀医院，北京100080;2北京大学第三医院)

高同型半胱氨酸血症(HHcy)是冠状动脉疾病(CAD)的独立危险因素［1］，其可以通过损害血管内皮细胞、促进炎症、氧化应激等机制导致血管内皮功能紊乱［2］。近年研究发现，Hcy可以通过降低血管内皮细胞四氢生物蝶呤(BH4)的生物利用度而引起内皮型一氧化氮合酶(eNOS)脱偶联，导致氧化应激及一氧化氮(NO)产生减少［3］。Coppola 等［4］给予 2型糖尿病患者蛋氨酸负荷造成急性HHcy后发现，患者冠状动脉内皮功能显著降低。然而，慢性HHcy是否对患者冠状动脉内皮功能有影响以及可能的机制尚不十分清楚。在本研究中，我们探讨慢性HHcy是否通过降低BH4的水平，引起eNOS的脱偶联，导致冠状动脉内皮功能的紊乱。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2008年9月～2009年5月，本研究采用病例对照的设计，入选病例均检测空腹Hcy浓度，以高于15 μmol/L为标准分为两组:健康对照组50例，其中男33例、女 17例，年龄(55.12±12.71)岁;HHcy组21例，其中男15例、女6例，年龄(52.90±13.23)岁。两组患者均排除急性心肌梗死、冠状动脉疾病(冠状动脉造影显示＞50%狭窄)、心力衰竭、肝肾功能异常、癌症、感染性疾病、服用硝酸盐类及B族维生素类药物影响指标测定等。

1.2 方法

1.2.1 血浆 BH4水平测定 取400 μl血浆置于EP 管中，加入100 μl 1 mol/L 三氯乙酸(TCA)，4 ℃20 000 g离心15min后，各取170 μl上清液转移到2个新的EP管中，分别进行酸、碱氧化。酸氧化过程:每 170 μl上清液中加入 25 μl酸性碘液(0.5%iodine、1%KI溶于 0.2 mol/L TCA 中)混匀后，室温避光静置60min，而后加入10 μl 1%新鲜配制的抗坏血酸，4 ℃ 20 000 g离心10min，取上清170 μl用于测定总的蝶呤水平(BH4+BH2+生物蝶呤);碱氧化过程:每 170 μl上清液中加入 10 μl 6 mol/L NaOH 和 25 μl碱性碘液(0.5%iodine、1%KI溶于0.2 mol/L NaOH中)，室温避光静置60min，而后加入10 μl 6 mol/L HCl及 10 μl 1%新鲜配制的抗坏血酸，4℃ 20 000 g离心10min，取上清170 μl用于测定BH2和生物蝶呤的水平。经酸碱氧化处理后，即刻利用高效液相色谱仪器进行测定，条件为:流动相:甲醇/水 =5/95;流速:1.0 ml/min;柱温:25 ℃;激发和发射波长分别为350、440 nm，生物蝶呤出峰时间大约为8min，各实验组的测定含量通过标准曲线获得，BH4的含量由酸碱氧化差值得出。

1.2.2 冠状动脉内皮功能检测 冠脉血流速度储备(CFVR)在一定程度上反映冠状动脉内皮功能，由经胸超声心动图血流显像技术检测。在冠脉血流显像模式下记录静息状态及最大充血状态下［应用腺苷0.14 mg/(kg·min)］左前降支血流速度峰值，计算充血状态及静息状态血流速度峰值比值，即为CFVR。

1.2.3 血浆NO水平的检测 采用硝酸还原酶法测定患者血浆NO含量，具体操作步骤参照试剂盒说明书进行(北京四正柏生物科技有限公司)。

1.2.4 血浆生化指标检测 患者血浆总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)、血糖、Hcy水平等指标，由医院检验科测定。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，实验数据以±s表示，计数资料采用两组频数的χ2检验，计量资料采用t检验，以P≤0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 Hcy、BH4、NO 及 CFVR 表达 见表1。

表1 两组研究对象血浆Hcy、BH4、NO及 CFVR 水平(±s)

表1 两组研究对象血浆Hcy、BH4、NO及 CFVR 水平(±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05

CFVR对照组组别 Hcy(μmol/L)BH4(pmol/ml)NO(μmol/L)11.3 ±2.2 1.73 ±0.52 119.5 ±36.7 3.09 ±0.50 HHcy组 23.2 ±10.1* 1.43 ±0.41* 99.6 ±32.2* 2.76 ±0.50*

2.2 相关性分析 所有患者中，以血浆NO为应变量，以Hcy为自变量，结果显示血浆NO浓度与Hcy呈负相关性(r= －0.28，P ＜0.05);以 CFVR 为应变量，以Hcy为自变量，结果显示CFVR与Hcy呈显著负相关性(r= －0.34，P ＜0.05)。

3 讨论

HHcy是心血管疾病的独立危险因素。本研究中我们发现，慢性HHcy患者冠状动脉内皮功能明显受损，同时伴有血浆BH4和NO水平的降低;患者血浆BH4和NO水平呈显著正相关性;此外，血浆Hcy水平与NO、CFVR分别呈显著负相关性。从而提示慢性HHcy可能通过降低BH4生物利用度引起eNOS的脱偶联，导致NO产生减少及冠状动脉内皮功能紊乱。

血管内皮细胞产生的NO对维持血管稳态起着至关重要的作用，如维持血管张力、抑制血小板的聚集、白细胞的迁移以及黏附、抑制炎症反应和平滑肌细胞的增殖等。因而，NO的生物学活性降低是内皮功能不全的标志性事件［5］。NO是由eNOS催化底物精氨酸转为瓜氨酸而产生，此过程需要辅助因子BH4的参与。当BH4减少或缺乏时，eNOS产生的NO减少，而ROS产生增加，此过程称之为eNOS的脱偶联。我们的研究也发现患者血浆NO和BH4水平是呈正相关性的，从而提示BH4在NO产生途径中起着重要作用。

一系列的研究表明，HHcy可以通过增加氧化应激、降低NO生物利用度引起血管内皮功能的紊乱。Hcy可以通过降低血管内皮细胞BH4的生物利用度而引起eNOS脱偶联，导致氧化应激及NO产生减少［3］。Hcy降低内皮依赖的血管舒张功能并能增加内皮细胞超氧阴离子的产生，而给予BH4预处理后，内皮依赖的血管舒张功能得到改善的同时伴有内皮细胞超氧阴离子产生减少［6］。我们前期研究发现，Hcy可能通过活化NADPH氧化酶途径，诱导ROS产生及分泌趋化因子，从而加速动脉粥样硬化的进程［7，8］。我们临床试验也发现急性冠脉综合症患者血浆Hcy及MCP-1的水平显著升高［9］。在本研究中我们发现慢性HHcy患者血浆BH4和NO水平是显著降低的，同时伴有CFVR水平的降低，后者在一定程度上能反映患者冠状动脉内皮功能［10］。Coppola等［4］给予 2 型糖尿病患者蛋氨酸负荷造成急性HHcy后发现，患者CFVR水平也是显著降低的，这与我们的结果相一致。此外，我们的研究还发现血浆Hcy水平与NO、CFVR分别呈负相关性，提示慢性HHcy是引起冠状动脉内皮功能损伤的危险因素。

综上所述，慢性HHcy可能通过降低BH4的生物利用度引起eNOS脱偶联，导致NO产生减少及冠状动脉内皮功能紊乱，最终导致冠状动脉疾病的发生。

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