肺胀阳虚水泛证动物模型的建立方法

韦衮政 和菊花 刘涛 钱锐 张馨予 储丽英 祁向荣

肺胀是中医学对多种肺系疾病所致肺气胀满、不能敛降的一类疾病的总称，相当于现代医学的慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)。既往的动物实验可以形成慢性支气管炎、肺气肿、肺心病、心衰各阶段动物模型。本病证的特点是气道有慢性炎症改变、肺气肿和右心衰同时存在。以往的造模处理因素比较单一，与本病证复杂的临床病理实际差距较大，拟建立造模因素与临床病理因素相类似、病理改变与临床特征更相符的病证模型，形成慢性气道炎症、肺气肿和右心衰的统一体，形成肺胀阳虚和水泛的统一体。本实验从肺胀的病机出发，借鉴以往的造模经验，建立肺胀阳虚水泛证动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物

动物：SD大鼠，雌雄各半，体重200～250 g，许可证号：SCXK(滇)2005-0008，由昆明医学院实验动物中心提供。

1.2 试剂与仪器

脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)，Sigma公司产品，型号L2880，规格10 mg，批号055∶B5。野百合碱(Crotaline)，Sigma公司产品，型号C2401，规格500 MG，批号119K1579。氢化可的松，天津金耀氨基酸有限公司产品，国药准字H12020886，规格25 mg/5 ml。阿霉素(盐酸多柔比星)，浙江海正药业股份有限公司产品，国药准字H33021980，批号100301，规格10 mg/瓶。芙蓉牌过滤嘴香烟，湖南中烟工业有限责任公司出品，焦油量：12 mg/支。西门子超声心动图仪型号SEQUOIA512，探头型号15L8W-S。自制双层铁架80 cm×50 cm×50 cm，外套可上下移动的透明薄膜，顶膜开通直径1.5 cm通气圆孔6个。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组：选取健康合格实验动物SD大鼠64只，随机分为空白对照组10只；氢化可的松对照组12只；阿霉素对照组12只；阿霉素低剂量组15只；阿霉素高剂量组15只。造模过程是连续的，大体上分为4个阶段。

1.3.2 建立慢性支气管炎、肺气肿模型阶段：氢化可的松对照组、阿霉素对照组、阿霉素低剂量组分别于实验第1、21天气管内每次注入LPS各0.2 mg(0.1 ml)；阿霉素高剂量组分别于实验第1、21、51天气管内每次注入LPS各0.2 mg(0.1 ml)，空白对照组分别于实验第1、21天气管内注入生理盐水0.1 ml/次。气管内注入脂多糖方法：1%苯巴比妥钠80 mg/kg腹腔注射，麻醉后，暴露喉头，以静脉套管针替代气管导管行气管插管，向大鼠气管内注入LPS 0.2 mg，完毕后将大鼠垂直旋转10～20秒，使LPS均匀分布于肺部。自实验开始的90天内，除气管内注入药物、肌肉注射或腹腔注射药物的当天外，其余时间均将大鼠置于密闭透明塑料薄膜箱内，箱下小铁架上点燃香烟，拉下塑料薄膜罩住烟雾，香烟用量30支/(m3·15min)，每次连续30分钟，每天1次。空白对照组置正常空气中呼吸。

1.3.3 建立肺动脉高压模型阶段：实验第61天造模大鼠腹腔内一次性注射2%野百合碱溶液，氢化可的松对照组、阿霉素对照组、阿霉素低剂量组60 mg/kg，阿霉素高剂量组70 mg/kg。空白对照组一次性腹腔注射生理盐水2 ml。

1.3.4 建立阳虚模型阶段：实验第63天起造模大鼠臀部肌肉注射0.5%注射氢化可的松，阿霉素对照组、阿霉素低剂量组每次20 mg/kg，阿霉素高剂量组每次30 mg/kg，每天下午1次，连续7天。空白对照组、氢化可的松对照组大鼠臀部肌肉注射生理盐水1 ml。

1.3.5 建立右心衰模型阶段：实验第71天开始造模大鼠腹腔注射1‰阿霉素每次2 mg/kg，每周1次，低剂量组共6次，累计用量为12 mg/kg，高剂量组共8次，累计用量16 mg/kg。空白对照组、阿霉素对照组每次腹腔注射生理盐水2 ml，每周1次，共6次。

1.4 一般观察

观测大鼠的一般情况：心率、呼吸状态、体重、饮食、精神、活动动作、姿态、毛发、鼻色、眼睑、喘鸣、咳嗽、皮肤、下肢、爪、大便、小便等。

1.5 检测项目

1.5.1 心脏超声心动图检测

各组于烟熏前、氢化可的松肌肉注射结束后第1天、阿霉素腹腔注射结束后第7天(阿霉素对照组同阿霉素低剂量组、空白对照组同阿霉素高剂量组)，分别行心脏超声心动图检查。先行1%苯巴比妥钠80 mg/kg腹腔注射，麻醉后胸腹区备皮，仰卧位固定，采用超声心动图仪，14 MHz高频探头，标准胸骨旁左室长轴、短轴、心尖四腔切面，测量左心室舒张末期内径(LV-Diastole)、左心室收缩末期内径(LV-Systole)、射血分数(LVEF)。

1.5.2 测量尿量

各组于烟熏前、氢化可的松肌肉注射结束后第2、3天、阿霉素腹腔注射结束后第8、9天(阿霉素对照组同阿霉素低剂量组、空白对照组同阿霉素高剂量组)，分别收集大鼠自由饮水情况下和禁水情况下24小时尿量。

1.5.3 探查内脏

实验结束时，颈椎旋转法处死大鼠，切开胸腹腔，观察心包、心脏、肺脏、胸水、腹水情况，从环状软骨上缘切断气管，修去脂肪，取出心和肺，沿心脏外缘剪去大血管，滤纸吸去血液，观察肺脏、心脏、心包表面情况，称量心、肺重量(包括气管)，计算肺脏与体重、心脏与体重的比值。

1.6 统计方法

2 结果

2.1 症状

动物一般情况：烟熏开始时大鼠憋气、咳嗽、乱窜，寻找地方躲藏，10分钟后开始汗出、流涕，乏力，继而静止不动，停止烟熏、正常空气呼吸后开始活跃。气管内注入脂多糖后1小时内，大鼠出现严重刺激性咳嗽、呼吸困难。烟熏30天后大鼠精神欠佳，活动减少，时有咳嗽，毛发烟黄色。2个月后出现偶有喉间哮鸣音，呼吸急促，消瘦。肌肉注射氢化可的松后第2天即出现畏寒、弓背、缩身、体毛枯疏蓬松等肺阳虚表现。注射阿霉素后期大鼠精神极度萎靡，行动迟缓，咳嗽加重，呼吸急促，畏寒，弓背、缩身，体毛枯疏蓬松无光泽，眯眼，极度消瘦，纳食减少，尿量减少等衰竭表现。阿霉素高剂量组衰竭表现较重，阿霉素对照组无衰竭表现。氢化可的松对照组无阳虚表现。空白对照组则活泼好动，体肥，皮毛亮泽紧密色白，无明显咳嗽、气促、纳差、尿少等表现。

2.2 尿量变化

从预实验的观察中得知，在自由饮水情况下，部分大鼠的尿量过多，组内差别相当大，与饮水量明显相关，而在禁水情况下，组内悬殊明显缩小。末次大鼠正常饮水和禁水情况下24小时平均尿量见表1。

末次大鼠24小时尿量在自由饮水情况下，阿霉素高剂量组、阿霉素低剂量组与空白对照组相比有显著性差异；在禁水情况下，阿霉素高剂量组与空白对照组相比有显著性差异。

表1 末次大鼠24小时尿量

2.3 超声心动图检查结果

氢化可的松阶段大鼠心脏扩大不显著，阿霉素注射后大鼠心肌肥厚、心脏扩大、心功能下降，高剂量组更为显著。各组左心室舒张末期内径、收缩末期内径及射血分数超声心动图检测结果见表2-3。

末次阿霉素对照组、氢化可的松对照组大鼠左心室舒张末期内经、左心室收缩末期内经、射血分数与空白对照组相比无显著性差异。末次阿霉素高剂量组、阿霉素低剂量组大鼠左心室舒张末期内经、射血分数与空白对照组相比有显著性差异，末次阿霉素高剂量组大鼠左心室收缩末期内经与空白对照组相比有显著性差异，末次阿霉素高剂量组大鼠射血分数与阿霉素低剂量组相比有显著性差异。

表2 末次大鼠心脏超声检测结果

表3 实验前后各组大鼠心脏超声检测结果

氢化可的松对照组大鼠左心室舒张末期内经前后相比有显著性差异。阿霉素对照组、阿霉素低剂量组、阿霉素高剂量组大鼠左心室舒张末期内径、左心室收缩末期内径、射血分数实验前后相比有显著性差异。

2.4 腹腔脏器表现

成模后部分大鼠出现心包积液、胸腔积液、腹腔积液，腹腔积液量多达8 ml，以阿霉素高剂量组为多见。部分大鼠出现肺脏瘀血斑点，少数出现心脏瘀血斑点，空白对照组无内腔积液、瘀血表现。肺脏与体重、心脏与体重的比值相比无显著性差异。见表4。

表4 大鼠肺脏重量、心脏重量与体重的比值

2.5 成模率

预实验时，大鼠高剂量(每次50 mg/kg)氢化可的松肌肉注射后立即死亡的1只，第2天死亡2只，正式实验时减少氢化可的松剂量。随着阿霉素剂量的增加，死亡率相对增高。本实验总死亡率在20%左右。经过香烟反复熏吸、气管内注入脂多糖后大鼠肺脾气虚证的成模率达90%以上，氢化可的松肌肉注射后阳虚证成模率达100%，按形成心包积液、胸腔积液、腹腔积液计算，阿霉素高剂量组阳虚水泛证成模率达40%。

3 讨论

肺胀是中医病名，在《灵枢经·胀论》中已有记载，“肺胀者，虚满而喘咳”[1]。肺胀阳虚水泛证是肺胀的一个证型，汉代《金匮要略·水气病脉证并治》云：“咳而喘，不渴者，此为肺胀，其状如肿[2]”，严重时可出现“咳逆倚息，短气不得卧，其形如肿”的症状，这就是肺胀阳虚水泛证。COPD以气流受限不完全可逆为特征，以肺功能检查为指标，临床上以咳、痰、喘为表现。肺胀同样以咳、痰、喘、甚则肿为主要表现，肺胀与COPD 不完全相等，但大部分重叠。从症状上看，肺胀阳虚水泛证与COPDⅣ期(极重度)伴右心衰症状相似。右心衰的水泛属阴水性质，右心衰的本质属阳虚范畴，与肾、脾、心阳虚有关。

COPD是多因素诱发的一种疾病，病情的发展多数经历了慢性支气管炎、肺气肿、肺动脉高压、肺心病、心衰的过程。许多学者模拟COPD的病理变化和临床特征，对动物模型进行了多项研究。如利用烟熏法建立肺气肿动物模型[3]。采用烟熏40天加气管内注入脂多糖(LPS)的方法可以成功制备COPD模型[4]。野百合碱可引起肺血管内皮细胞损伤、肺血管重建，导致肺心病肺动脉高压[5,6]。在研究阳虚的模型中，以皮质激素模型为最多、最可靠[7]。应用阿霉素腹腔注射，累计剂量24 mg/kg，6周后可形成心衰模型[8]。

本实验基于重症COPD的病理过程，应用多种致病因素，复合造模。通过序贯应用香烟反复熏吸、气管内注入脂多糖、野百合碱腹腔注射、氢化可的松肌肉注射及阿霉素腹腔注射，可以引起大鼠心脏扩大、心肌肥厚、左心室舒张期末内径增大、左心室收缩期末内径增大、左心室射血分数下降，严重时形成心包积液、胸腔积液、腹腔积液改变。从表现来看，形成了肺胀阳虚水泛证动物模型。肺胀阳虚水泛证动物模型的形成是多种因素的累积效应，香烟反复熏吸、气管内注入脂多糖、野百合碱腹腔注射可形成肺胀肺脾气虚型动物模型；在此基础上，应用氢化可的松肌肉注射，可以形成肺胀阳虚证；继续应用阿霉素腹腔注射，可以形成肺胀阳虚水泛证，与临床常见的重症慢性阻塞性肺疾病表现相类似。快速出现阳虚症状的因素是氢化可的松，引起阳虚水泛的关键因素应是阿霉素，因单用野百合碱腹腔注射未见到水泛现象，如果是重叠效应，仍以阿霉素高剂量组多见。在人体，水泛多表现在下肢部位，显而易见。而在爬行动物，四肢肌肉血管较少，下肢水液坠积不显著，较难形成下肢水肿现象，水液容易积聚在胸腹部。实验中氢化可的松肌肉注射后大鼠较快死亡的原因有待进一步探讨。通过形态观察、腹腔探查、心脏超声心动图检查等，可以认为该实验形成了肺胀阳虚水泛证动物模型。该模型烟熏时间长，心功能下降显著，是一种有效的肺胀阳虚水泛证动物模型造模方法。

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[2] 汉·张仲景撰.金匮要略[M].北京:人民卫生出版社,2005:53.

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[8] 李梅秀，田国忠，欧叶涛，等.大鼠阿霉素慢性心衰模型的制备与心衰指标的判定[J].解剖学研究,2005,17(3):176.