mTOR信号通路对扩张性心肌病大鼠心肌纤维化进程调控作用的实验研究

于溯洋 柳磊 李普

心肌纤维化重构主要指心肌细胞外间质内胶原含量或容积分数显著增高，是扩张型心肌病的主要组织病理学改变［1，2］。心肌成纤维细胞是心脏的主要间质细胞，其分泌的Ⅰ型和Ⅲ型胶原构成心肌间质网络的基本结构。心肌成纤维细胞的功能及结构改变在心肌纤维化发展过程中起十分重要的作用。哺乳类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是细胞生长的中心调控因子，可以通过调控细胞外间质胶原蛋白的合成代谢影响器官纤维化进程。真核起始因子(eukaryotic initiation factor，eIF)是 mTOR的下游底物，当生长信号激活mTOR后，eIF-4E脱落，从而启动蛋白质的翻译［3］，eIF-4E通过调节mRNA的输出速度而影响细胞生长和细胞周期进程，促进细胞生长、增殖。我们通过观察扩张性心肌病大鼠心肌组织中mTOR和eIF-4E的mRNA表达变化及与心肌间质胶原容积分数相关性，探讨mTOR信号通路在扩张性心肌病大鼠心肌纤维化过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 2周龄Wistar大鼠30只，雌雄各15只，体重(64±6)g，由河北医科大学实验动物中心提供。对所有大鼠进行编号，并随机分为扩张性心肌病模型组(DCM组)和对照组，每组15只。

1.2 方法

1.2.1 模型制备:阿霉素是一种高效、广谱抗肿瘤蒽醌类药物，由于阿霉素与心肌组织的亲和力明显高于其他组织，因此有严重的心脏毒性，利用阿霉素制作扩张性心肌病的模型是已得到公认的廉价、简单、实用的方法［4］。DCM组大鼠模型建立及标本制作:按体重2.5 mg/kg剂量尾静脉注射阿霉素(浙江海正药业)，每周2次，连续6周，总剂量30 mg/kg。对照组注射相同体积的注射用水。喂养到第6周时以10%水合氯醛麻醉后，剪去胸毛，经超声多谱勒仪取二尖瓣长轴切面行心动图检测各大鼠左心室结构和心功能参数:包括左心室舒张期末内径(LVEDD)、左心室收缩期末内径(LVESD)、射血分数(LVEF)、左心室内径缩短率(FS)等。共取15个心动周期平均所得数作为测量值;然后处死大鼠，剪取左心室游离壁心肌组织0.9%氯化钠溶液冲洗并除去脂肪后分为2块，1块液氮保存用于检测mRNA，1块10%甲醛溶液固定用于苦味酸-天狼星红染色后行胶原容量分析。

1.2.2 病理学检测:标本用中性10%甲醛溶液固定，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，行连续切片，切片厚度为4 μm，常规行天狼星红染色:①经10%甲醛固定的组织取材大小1 cm×1 cm×0.2 cm;②病理常规脱水、透明、浸蜡、包埋;③石蜡切片厚度4 μm;④二甲苯脱蜡至水洗;⑤置0.1%苦味酸天狼星红染液中1 h;⑥自来水流水冲洗4 min;⑦染Harris’s苏木素5 min;⑧各级浓度乙醇内脱水;⑨二甲苯透明、中性树胶封片;⑩在偏振光显微镜下观察。并用HPIAS-1000型高清晰度彩色病理图文报告分析系统分析胶原容积积分(PCV)。

1.2.3 RT-PCR检测:Trizol法提取细胞总RNA并进行反转录。分别抽提对照组和DCM组成纤维细胞的总RNA。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参照，进行RT-PCR检测。GAPDH:上 游 5 ＇-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ＇，下 游 5 ＇-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3＇，扩增产物长度452 bp。mTOR引物:上游 5＇AAGATGCTTGGGACAGGC3＇，下游 5＇GGTCCGAAGGTAGTTGG3＇，扩增产物长度 343 bp;p70S6K 引物:上游 5＇TTTTGGCTCGGAAGGTGG3＇，下游 5＇TGTCGGATTGGAAGTGGC3＇，扩增产物长度421 bp;电泳图象以GelprO4版凝胶光密度分析软件进行分析，其代表数值为平均光密度值，代表相应基因的表达量。并除以GAPDH的平均光密度值，所得数值作为各扩增产物的mRNA相对表达量。

1.3 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组选模资料 DCM组15只大鼠中，1只大鼠死亡，14只成模;成模大鼠出现扩张型心肌病病理改变。对照组15只大鼠无死亡。

2.2 2组大鼠超声心动图比较 与对照组比较，DCM组LVEDD、LVESD 明显增加(P＜0.05)，LVEF、FS明显降低(P＜0.05)。见表1。

表1 2组大鼠LVEDD、LVESD、LVEF、FS的比较

表1 2组大鼠LVEDD、LVESD、LVEF、FS的比较

组别 LVEDD(cm) LVESD(cm) FS(%) LVEF(%)0.53± 0.29 0.30±0.18 36.4± 2.6 71.5±1.2 DCM 组(n=14) 0.61±0.03 0.37±0.05 28.6±4.1 61.5±6.1 P值对照组(n=15)0.030 0.028 0.037 0.028

2.3 天狼星红染色PCV检测结果 天狼星红染色及胶原容积积分结果:天狼星红染色，正常小鼠心肌胶原纤维主要分布在血管周围，心肌细胞间有少量的胶原纤维;DCM组除血管周围有胶原纤维外。心肌细胞间有大量纵横交错的胶原纤维，排列紊乱，胶原纤维的量要明显多于对照组(P＜0.05)。见表2、图1。

表2 2组PCV比较

表2 2组PCV比较

组别 PCV(%)1.51±0.31 DCM 组(n=14) 3.36±0.75 P值对照组(n=15)0.015

图1 心肌胶原形态特征及分布(偏振光显微镜×100)

2.4 左心室心肌组织mTOR、eIF-4EmRNA表达结果 RT-PCR扩增后，DCM组mTOR mRNA的表达量较对照组明显增加，经光密度值分析，其相对表达量是对照组的(1.8±0.08)倍(P＜0.05);DCM组eIF-4EmRNA的表达量较对照组亦明显增加。经光密度度值分析，其相对表达量是对照组的(1.97±0.06)倍(P＜0.05)。见表3。

表3 2组大鼠左心室心肌组织mTOR、eIF-4EmRNA表达比较

表3 2组大鼠左心室心肌组织mTOR、eIF-4EmRNA表达比较

组别0.0036 0.00510.38±0.03 0.73±0.07 DCM 组 0.68±0.03* 0.87±0.03*P值mTOR eIF-4E对照组

3 讨论

扩张型心肌病的主要组织病理学改变为心肌细胞凋亡和心肌细胞外间质纤维化病变。目前所关注的各种致纤维化因子有血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)、转化生长因子β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶及其组织抑制因子家族(MMPs/TIMPs)等，但心肌组织受到这些细胞因子作用后调控纤维化形成的具体信号传导机制仍不完全清楚。本结果显示扩张性心肌病大鼠模型其mTOR和eIF-4E的mRNA表达明显增加，并且DCM组织胶原容积(CVF)同时明显升高。结果提示mTOR/eIF-4E信号通路激活在扩张型心肌病心肌纤维化的进程中发挥一定作用。

mTOR整合来自于细胞内外的营养、生长因子、能量和环境压力等信号，通过调控细胞外基质Ⅰ型胶原蛋白的合成代谢影响器官纤维化进程。在心、肝、肺、肾、皮肤等器官的纤维化疾病过程中均发现了mTOR信号传导通路的激活，阻断mTOR可以抑制细胞外基质的沉积，减轻甚至逆转器官纤维化，因而抑制该信号通路已成为防治器官组织纤维化靶向治疗的热点［5－8］。Ikeda等［9］通过对心肌 LKB1 基因敲除激活 mTOR 信号通路的小鼠模型研究发现，mTOR及其下游调节蛋白表达增加，最终导致心肌间质胶原成分增多、纤维化，心房、心室直径扩大心功能恶化。Gao等［10］在束扎大鼠大动脉建立的鼠心肌肥厚模型中发现阻断mTOR信号通路可明显改善模型动物的心肌肥厚和纤维化，并且显著改善心肌肥厚纤维化所致的心功能恶化。以上研究成果证实了mTOR信号传导通路与各种原因所致器官纤维化疾病之间的关联。而本研究结果从实验动物水平证实mTOR/eIF-4E信号通路激活在扩张型心肌病心肌纤维化的进程中通过调控心肌间质胶原水平对心肌纤维化进程发挥重要作用。

然而，雷帕霉素对扩张性心肌病的干预是否可以调控mTOR通路进而阻断心肌纤维化的进程，从而为扩张性心肌病的有效治疗提供新的思路和理论基础，尚需我们进一步研究。

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9 Ikeda Y，Sato K，Pimentel DR，et al:Cardiac-specific deletion of LKB1 leads to hypertrophy and dysfunction.J Biol Chem，2009，284:35839-35849.

10 Gao XM，Wong G，Wang B，et al.Inhibition of mTOR reduces chronic pressure-overload cardiac hypertrophy and fibrosis.J Hypertens，2006，24:1663-1670.