新烟碱杀虫剂噻虫嗪免疫学特性研究

李广领,李新安,李金丽,肖娜娜,赵亚娟,陈锡岭（河南科技学院,河南新乡453003）

新烟碱杀虫剂噻虫嗪免疫学特性研究

李广领,李新安,李金丽,肖娜娜,赵亚娟,陈锡岭
（河南科技学院,河南新乡453003）

通过化学修饰合成了噻虫嗪（thiamethoxam,TMX）人工半抗原,采用碳二亚胺法（EDC）将该抗原与牛血清蛋白和卵清蛋白偶联成功制备了分子结合比合理的免疫抗原（TMX-BSA）和包被抗原（TMX-OVA）.对经TMX-BSA免疫的6周龄Balb/c实验鼠的免疫抗血清进行了间接ELISA和阻断ELISA,初步明确了抗噻虫嗪多克隆抗体（TMX-pAb）的免疫学特性,为噻虫嗪残留免疫学快速检测技术开发和检测产品研制奠定了坚实基础.

噻虫嗪；单克隆抗体；残留；酶联免疫吸附测定法

噻虫嗪（thiamethoxam,TMX）是诺华公司于1991年成功开发的第二代新烟碱类杀虫剂.从结构看,它以2-氯-5-噻唑基和甲基作为药效基团,是对恶二嗪先导化合物最理想的修饰结合；从作用靶标看,它作用于昆虫烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）,干扰昆虫中枢神经系统的信号传导,导致害虫麻痹死亡,作用方式新颖[1-2]；从杀虫活性看,它有比第一代新烟碱杀虫剂更强的触杀、胃毒和内吸活性,而且其在植物体内降解速度相对较慢,因而,它不仅可用作叶面喷雾,还可以进行土壤处理和种子处理[3]；从杀虫谱看,它对几乎所有咀嚼式口器害虫和绝大多数刺吸式口器害虫都有优良防效,尤其是在控制对常规有机磷、氨基甲酸酯和拟除虫菊酯杀虫剂产生抗性的害虫方面优势非常突出；从安全性看,它对哺乳动物低毒,无致畸、致突变效应[4].基于噻虫嗪以上特点,近年来它在农业生产上被大量、广泛应用,但靶标昆虫的抗药性[5-8]、在农产品中的高水平残留问题随之出现.关于农产品和环境样品中噻虫嗪残留测定方法已有报道,其中最常用的是色谱法[9-13],随着小分子药物免疫检测技术的不断发展和完善,其筛查能力强、检测快速、成本低廉的检测特性受到广泛关注[14-15].根据药物免疫分析的基本原理和要求,基于噻虫嗪的小分子特性,通过化学修饰改变其分子结构,再与大分子载体共价偶联,制备其完全抗原,通过免疫实验动物产生针对该农药的特异性抗体,旨在为噻虫嗪残留免疫学快速检测技术开发提供理论依据和技术支持.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

DU-800型UV-vis（Beckman公司）、LCQDeca XPMAX型HPLC-MS（Finnigan公司）、TENSOR27型IR（Bruker公司）、Gene Quant Pro型核酸蛋白含量测定仪（英国Amersham Biosciences公司）、VARIOSKAN FLASH型酶标分析仪（Thermo公司）等.

吡虫啉（imidacloprid）、啶虫脒（acetamiprid）、噻虫啉（thiacloprid）、噻虫胺（lothianidin）标准品,购于国家标准物质研究中心；95%的噻虫嗪原药,上海诺泰化工有限公司产品；β-巯基丙酸、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、碳二亚胺（EDC）、牛血清蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）、羊抗鼠IgG-HRP、RPMI-1640、HAT、PEG-1500,均为Sigma公司产品.

2.2 试验动物

6周龄SPF级雌性Balb/c实验小白鼠,购于郑州大学实验动物中心,室验室饲养.

2.3 试验方法

2.3.1 人工半抗原和完全抗原的制备与结构鉴定利用β-巯基丙酸与TMX的缩合反应制备TMX人工半抗原.具体方法为：用20mLDMSO在250mL烧瓶中溶解5.8 g噻虫嗪原药,加入2.25 g KOH,搅拌下将β-巯基丙酸溶液（2.1 gβ-巯基丙酸溶解于10mLDMSO）用恒压漏斗缓慢滴加至反应烧瓶,于100℃油浴下反应2 h,待产物自然冷却至室温后,加入50mL水,以6mol/L的盐酸调节反应液pH为3.将此混合液转移至分液漏斗,用90mL二氯甲烷分3次萃取,收集有机相.用75mL 1mol/L的NaHCO3水溶液分3次洗涤二氯甲烷提取液,收集水相.再用6mol/L的盐酸调节水相pH为3,然后用90mL乙酸乙酯分3次提取水相,合并乙酸乙酯提取液.提取液经无水硫酸钠干燥和减压浓缩,得黄色粘稠液体.加入少量丙酮溶解,静置过夜,有黄色结晶析出,过滤得目标化合物.噻虫嗪人工半抗原合成路线见图1.

图1 TMX人工半抗原的合成路线

采用EDC两步法合成免疫抗原（Hapten-BSA）和包被抗原（Hapten-OVA）.具体方法为：将14.7mg/mL合成的噻虫嗪人工半抗原与20mg/mLBSA的PBS溶液混合,室温下低速震荡过夜,再以3 000 rpm离心5min,弃去沉淀,在上清液中加入2mLNHS作保护剂,然后逐滴加入5mg/mLEDC水溶液,继续振荡5 h,再以3 000 rpm离心5min,上清液用PBS连续透析3 d,其间每隔8 h更换新鲜透析液,透析完毕后分装,即得免疫抗原（Hapten-BSA）,于-20℃下保存备用.再将BSA换为OVA,采用与TMX-BSA合成相同的步骤合成包被抗原（Hapten-OVA）,供包被酶标板之用.噻虫嗪免疫抗原和包被抗原的合成路线见图2.

图2 TMX完全抗原的合成路线

以HPLC分离TMX半抗原并用MS鉴定其合成情况,用IR、UV扫描其半抗原、完全抗原和载体蛋白（BSA）,确定半抗原与载体蛋白的偶连情况.参考王俊东等[16]方法,测定并计算TMX完全抗原与载体蛋白的偶联比,根据“结合比=[（ε偶连物-ε载体蛋白）/ε半抗原]”计算半抗原与载体蛋白的结合比.

2.3.2 噻虫嗪免疫学特性鉴定以TMX-BSA 50μg·0.2mL/只的免疫剂量,对5只实验鼠背部皮下多点免疫,加强免疫于首次免疫后4周进行,共进行4次,各次免疫间隔期均为3周.末次加强免疫后10 d,断尾采血测抗体效价[17]、抗体对噻虫嗪的抑制效果和对噻虫嗪结构类似物的交叉反应情况.

2 结果与分析

3.1 噻虫嗪人工半抗原、完全抗原的结构鉴定

3.1.1 半抗原的MS鉴定以HPLC分离和MSD检测到的噻虫嗪人工半抗原的ESI-MS见图3.

图3 噻虫嗪人工半抗原的ESI-MS

结合有机化合物氮规则,由图3中不同碎片离子的相应m/z知,相对丰度约为50%的m/z为376.68的碎片离子峰应为合成半抗原的分子离子峰[M+1]；m/z为329.67的碎片离子峰为基峰,对应于合成半抗原分子失去NO2产生的碎片离子；同时谱图中m/z为61.19、87.22、120.82、161.01、256.93和359.15等碎片离子峰与噻虫嗪人工半抗原分子不同裂解碎片均具有合理的归属关系,表明噻虫嗪人工半抗原合成成功.

3.1.2 完全抗原的IR鉴定合成半抗原、载体蛋白（BSA/OVA）和完全抗原的IR见图4.

图4 半抗原、载体蛋白和完全抗原的IR

由图4可见,载体蛋白与免疫抗原（Hapten-BSA）和包被抗原（Hapten-OVA）在3 300～3 500 cm-1和1 500～1 700 cm-1范围内吸收特征极为相似,这是BSA/OVA中氨基酸的特征吸收,说明所合成完全抗原中具有载体蛋白的特征官能团；另外,Hapten-BSA、Hapten-OVA的IR与半抗原的IR在800～1 300 cm-1之间,还出现了类似的半抗原的特征吸收,其中1 200～1 400 cm-1为TMX药效基团的硝基和甲基,而BSA和OVA在该波数附近无吸收,说明TMX完全抗原中具有半抗原的特征官能团,据此可以判定TMX半抗原与BSA/OVA偶联成功,即免疫抗原和包被抗原合成成功.

3.1.3 完全抗原的SDS-PAGE鉴定合成免疫抗原（Hapten-BSA）和包被抗原（Hapten-OVA）的SDS-PAGE见图5.

图5 TMX免疫抗原和包被抗原的SDS-PAGE

由图5可见,Hapten-BSA和Hapten-OVA的电泳谱带与所用Marker中BSA和OVA的谱带完全对应,说明所制备免疫抗原与包被抗原分别成功偶连了BSA和OVA.

3.1.4 完全抗原的UV鉴定噻虫嗪人工半抗原、载体蛋白（BSA、OVA）免疫抗原和包被抗原的UV见图6.

图6 TMX人工半抗原、免疫抗原与载体蛋白（BSA）的UV

由图6紫外扫描图谱可见,半抗原和载体蛋白的最大吸收峰分别位于257 nm和278 nm；而偶联物（Hapten-BSA和Hapten-OVA）的最大吸收峰介于275～278 nm之间,说明半抗原与载体蛋白偶联成功.根据半抗原、载体蛋白和偶连物的OD280,计算它们在280 nm下的摩尔吸光系数,按1.3.1中偶连率估算公式,算得半抗原与BSA的分子结合比为23.5︰1,半抗原与OVA的分子结合比为16.7︰1.另用核酸蛋白含量测定仪测得Hapten-BSA蛋白含量为11.96mg/mL,Hapten-OVA蛋白含量为8.05mg/mL.

3.2 抗血清效价测定

以5μg/mL的TMX-OVA包板和1︰1 000倍鼠阴性血清、1︰1 000倍RaMIgG-HRP按1.3.3效价测定方法测得不同稀释倍数多抗血清（TMX-pAb）的效价,结果见表1.

表1 间接ELISA检测TMX-pAb的OD450

由表1中标记“*”的OD450可以看出,用所制备TMX-BSA免疫的5只实验鼠均产生了较高效价的TMX-pAb,说明既定免疫剂量、免疫方式和免疫程序切实可行.其中1号免疫鼠和3号免疫鼠的抗血清效价最高,均达到了1︰2.56×104；其次为4号和5号免疫鼠,它们的抗血清效价为1︰1.28×104,抗血清效价最低的2号免疫鼠,也达到了1︰6.4×103.

TMX-pAb对TMX结构类似物的交叉反应见表2.

24 TMX-pAb对TMX结构类似物的交叉反应

由表2可知,TMX-pAb对啶虫脒和烯啶虫胺无识别反应,交叉反应率均小于1%；对吡虫啉、噻虫啉和噻虫胺有弱识别作用,但交叉反应率均低于5%；对实验合成的半抗原有高度交叉反应性,交叉反应率达到了102.41%.

3 结论

药物半抗原的分子结构特点决定了通过其制备的抗体的特异性与亲和性,通过不同结构的半抗原制备的免疫抗原免疫动物所产生的抗体的亲合性与特异性差别往往很大,因此,药物半抗原的设计与合成是建立小分子免疫化学分析的关键.考虑到小分子的抗原物质不能被大分子的载体蛋白所“淹没”,同时考虑到半抗原分子可能会因折叠、弯曲等影响到抗体的识别特性,本研究通过对噻虫嗪化学结构的简单修饰,在远离噻虫嗪关键药效基团的分子远端引入了5个碳链长度的间隔臂,合成了噻虫嗪半抗原,并以此半抗原与载体蛋白相偶连制备的免疫抗原免疫实验动物制得了高交价的多克隆抗体,交叉实验证明了所制备多克隆抗体对同属新氯化烟碱杀虫剂的啶虫脒和烯啶虫胺没有交叉反应现象,吡虫啉、噻虫啉和噻虫胺有弱的交叉反应,这些差别与噻虫嗪本身的化学结构特点有关,其规律是与噻虫嗪结构类同点越多交叉反应率越高,可见噻虫嗪分子中的噻唑环和二嗪环在抗原抗体免疫反应中起着重要作用.

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（责任编辑：邓天福）

Study on immunological determ ination of im idacloprid residues

LiGuangling,Li Xin'an,Li Jinli,Xiao Nana,Zhao Yajuan,Chen Xiling
（Henan Instituteof Science and Technology,Xinxiang 453003,China）

Chemical modification method was employed to synthesize the thiamethoxam（TMX）hapten,which was then coupled with BSA and OVA to prepare immunogen（TMX-BSA）and coating antigen（TMX-OVA）through EDC method,respectively.And satisfied molecule coupling ratios between the TMX hapten and carrier proteins were eventually obtained.The immunological characteristics of TMX has been defined by indirect ELISA and blocking ELISA.This is an important and beneficial attempt to establish immunology rapid determination technology of TMX residues and develop corresponding determination products.

thiamethoxam,polyclonal antibody,residue,ELISA

S482.3

A

1008-7516（2011）05-0020-06

10.3969/j.issn.1008-7516.2011.05.005

2011-08-13

“十一五”国家科技支撑计划重大专项（2006BAK02A21/1）

李广领（1976-）,男,河南平顶山人,硕士,实验师.主要从事农药残留分析研究.

陈锡岭（1962-）,男,河南安阳人,教授,硕士生导师.主要从事农药环境毒理学研究.