体外法研究瘤胃筛选真菌对崂山奶山羊瘤胃发酵的影响

厉学武 王利华 孙艳朋 吕 娟 刘伟娟

纤维素是地球上最为丰富的有机物质，如果能够对其进行循环利用将对工农业产生巨大的积极作用。我国秸秆年产量高达7亿吨左右，其中玉米秸秆占有很大比重，是丰富的农业资源，但由于其木质纤维素含量高，生物降解缓慢，目前对其利用率不高。近年来对纤维素降解方面的研究已有不少报道，而最经济、环保的方法就是生物降解，因此越来越受到研究人员的关注。然而，纤维素降解高效菌种的缺乏仍然是目前利用生物降解木质纤维素的主要障碍因子之一。

厌氧真菌产生一系列降解植物细胞壁的酶，这些酶以协同有序的方式共同作用于植物细胞壁。同时，厌氧真菌的发酵过程还产生大量生物活性物质、有机酸和营养物质。因此，如果通过高效菌株的筛选，将其培养液通过浓缩处理，把这套天然复合酶体系添加到饲料中，效果很可能比常规的单一酶制剂和人工复合酶制剂更好。杨红建等（2010）研究了阿魏酸酯酶对羊草、玉米秸、稻秸及麦秸瘤胃体外发酵特性的影响。试验表明，在粗饲料中添加2%比例阿魏酸酯酶39℃预处理16 h后，瘤胃微生物发酵VFA的产生量增加3%～13.9%。亦可显著提高纤维性饲料的体外发酵产气量。

1 材料与方法

1.1 真菌来源

通过瘤胃真菌发酵筛选高酶活的木聚糖酶和羧甲基纤维素酶得到4株瘤胃真菌A、B、C和D。

1.2 试验动物、日粮及其饲养管理

本试验选取2只体格健壮、体重相当、装有永久性瘤胃瘘管的崂山奶山羊。每天饲喂两次（8:00和20:00），日粮组成中粗饲料：混合精料=7：3。试验羊于试验前驱虫，自由饮水，自由光照。

1.3 体外培养试验

1.3.1 体外培养设计

根据日粮中按玉米秸秆添加2%的4种筛选真菌，设置对照组和4种试验组，每组3个重复，分别排列于培养框架的前位与后位，以消除试验误差。培养底物玉米秸秆0.2 g，培养时间为24 h。

1.3.2 培养步骤

准确称取0.2 g秸秆饲料样品置于玻璃注射器的前端（体外发酵瓶），取30 ml始终用CO2气体饱和的人工瘤胃液加到每一个注射器中，按饲料的2%添加瘤胃真菌，用微量移液器将10 μl酶液添加至加酶组发酵瓶中,向瓶内持续通入CO2气体5 s,排净注射器中的空气，保持真空状态，并封闭注射器，然后在39℃的水浴锅中培养24 h。

1.3.3 瘤胃液的采集和人工瘤胃培养液的配置

晨饲（06:00）后2 h由2只崂山奶山羊瘤胃内上下左右不同位点采集足量瘤胃液，灌入经预热达39℃并通有CO2的保温瓶中，灌满后立即盖严瓶口，迅速返回试验室，经40目的尼龙布过滤后持续通入CO2气体5 min。将250 ml预先配制好并在39℃水浴中预热的培养液与1000 ml在39℃水浴中预热的蒸馏水混合之后再加入312.5 ml过滤后持续通入CO2气体的瘤胃液，混合，搅拌均匀置于39℃恒温水浴锅中保存，人工瘤胃液始终通CO2气体呈饱和状态，待用。

1.4 样品处理与分析方法

1.4.1 样品预处理

体外培养24 h后，将注射器取出，迅速放入冷水浴中终止发酵，并将注射器中发酵液排出至离心管中，然后将瘤胃液离心（4000 r/min离心15 min），上清液制样以备测定各个发酵指标。

1.4.2 NH3－N 的测定

参照冯宗慈等（1993）的比色法测定。

1.4.3 产气量（GP）

用注射器抽取30 ml制备好的人工瘤胃液（注射器提前装好0.2 g饲料样品），将注射器中的空气排净后封闭注射器，记录活塞的初始位置刻度，然后在39℃的水浴锅中培养24 h，读取24 h内各个不同时间点的产气量。

1.4.4 微生物蛋白产量（MCP）

微生物蛋白分离采用差速离心法。参照Cotta等（1982）和 Broderick等（1989）阐述的方法。

1.4.5 瘤胃液VFA浓度

按照曹庆云（2006）的气相色谱法进行瘤胃液挥发性脂肪酸的测定。

1.5 数据处理

试验数据采用Excel 2003软件进行整理，然后用Spss17.0软件对试验数据在0.05、0.01水平上进行方差分析和显著性检验，试验结果以平均数±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 4种瘤胃真菌筛选菌株对瘤胃液氨态氮（NH3－N）浓度的影响

表1 4种瘤胃筛选真菌对瘤胃液NH3－N的影响（mg/100 ml）

从表1可知，瘤胃筛选真菌D对瘤胃液NH3－N浓度的平均值比对照组显著提高（P＜0.05）。在培养的2、4和8 h时，筛选的4种真菌与对照组相比差异显著（P＜0.05）；从8 h后4种真菌的差异性显著程度逐渐缩小呈现不明显性；在24 h发酵结束后，4种筛选真菌对培养液NH3－N浓度与对照组差异性不显著(P＞0.05)。

2.2 4种瘤胃真菌筛选菌对瘤胃液产气量（GP）的影响(见表2)

表2 4种瘤胃真菌筛选菌株对瘤胃液产气量的影响(ml)

由表2可知，4种体外培养液中产气量的变化趋势一致，均随时间呈现不断增大的变化规律。在4 h时和8 h时，4种真菌与对照组相比差异不显著；在18 h时，只有真菌A与对照组差异显著（P＜0.05）；在12 h和24 h时，4种真菌都与对照组差异显著（P＜0.05）；在24h发酵结束时4种真菌的产气量与对照组相比分别提高了31.4%、25.5%、25.5%和31.5%。

2.3 24 h后，4种瘤胃真菌筛选菌对瘤胃液菌体蛋白（MCP）的影响(见表 3)

表3 4种瘤胃真菌筛选菌株对瘤胃液菌体蛋白的影响(g)

从表3可知，在24 h体外培养结束后，真菌B和D与对照组的差异性显著（P＜0.05）；真菌A和C与对照组的差异性不显著（P＞0.05）。

2.4 4种瘤胃真菌筛选菌在24 h时对瘤胃液挥发性脂肪酸（VFA）浓度的影响(见表4)

表4 4种瘤胃真菌筛选菌株对VFA浓度的影响(mmol/100 ml)

从表4可知，在24 h时，与对照组相比，日粮添加各种真菌的各组培养液中的VFA含量均差异显著（P＜0.05）。4种真菌的乙酸浓度与对照组相比差异显著（P＜0.05），真菌D与真菌A、B和C差异也显著（P＜0.05）；4种真菌的丙酸浓度与对照组相比差异显著（P＜0.05），而真菌A、B和D与对照组相比差异极显著（P＜0.01）；真菌C的丁酸浓度与对照组相比差异显著（P＜0.05），真菌A、B和D与对照相比差异极显著（P＜0.01）；在总VFA方面，真菌D的TVFA含量最高，达到了53.97 mmol/100 ml，与对照组相比差异极显著（P＜0.01），而其乙酸/丙酸为最低，并与对照组相比差异显著（P＜0.05）。

3 讨论

反刍动物瘤胃的发酵功能受多种因素(如日粮组成、动物本身的生理状况)的影响，其优劣表现在各个发酵指标上，包括pH值、VFA含量、MCP含量、产气量和NH3－N浓度等。Lee等（2000)报道，给绵羊瘤胃每天灌注200 ml厌氧真菌培养物(包括厌氧真菌酶和厌氧真菌细胞)后，绵羊对营养物质的利用率提高，对氮在瘤胃中的保护作用亦提高。

在整个试验培养过程中，各添加组的瘤胃氨氮浓度变化范围为11.96～19.65 mg/100 ml，处于已报道的最佳 NH3－N 浓度（6.3～27.5 mg/100ml）范围之内。杨红建等（2010年）研究了阿魏酸酯酶处理对羊草、玉米秸、稻秸及麦秸瘤胃体外发酵特性的影响。试验表明，2%阿魏酸酯酶添加预处理亦可显著提高羊草和麦秸的体外发酵产气量（+42.2%和+16.6%），麦秸体外发酵产气速率提高37.5%。杨亮宇（2002）用瘤胃持续模拟技术研究玉米和稻草在瘤胃内发酵产生总挥发性脂肪酸（TVFA）量、VFA 能。结果表明：添加 A、B、C、D、E和F的6种真菌培养物发酵的玉米和稻草0～72 h的TVFA 每 100 ml 中 分别 为 5.07、4.31、8.77、4.30、9.75、3.33 mmol和 4.09、23.36、8.68、7.66、9.95 和 2.94 mmol，发现以E菌处理的产酸量和VFA能最高。试验中，添加筛选瘤胃真菌的丙酸浓度极显著提高、乙酸/丙酸的比例均呈现下降趋势，使瘤胃发酵中丙酸发酵比例增加，改变了发酵模式，提高反刍动物对发酵终产物的利用率。在培养液中按培养底物秸秆添加2%的筛选真菌A、B、C和D可显著提高培养液中的菌体蛋白和VFA含量，产气量和NH3－N含量相对于对照组也有一定程度的提高。说明添加筛选瘤胃真菌可为反刍动物生长发育提供更充分的能量，促进其生长。纵观4种筛选真菌对瘤胃总体发酵功能的影响，可以发现真菌D对改善瘤胃发酵功能的综合作用效果最为理想。

4 小结

在体外条件下，添加瘤胃筛选真菌能改善瘤胃的发酵特性，而且这种改善状况受真菌种类影响。从本试验的结果来看，4种筛选真菌对瘤胃发酵都有一定的影响。整体来看，筛选真菌D对提高崂山奶山羊的瘤胃发酵功能效果最好，真菌D工业化大规模生产工艺正在研究之中，可继续研究在饲用酶浓缩剂或酶制剂生产中有所应用。

10篇，刊略，需者可函索）