Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)对克氏原螯虾代谢酶的影响

1 材料与方法

1.1 材料

试验用克氏原螯虾购于盐城郊区龙虾养殖场，体质量为 (11.35±1.52)g。

主要药品有:氯化镉 (CdCl2·2.5H2O，分析纯)，由上海金山亭新化工试剂厂生产;硫酸铜(CuSO4·5H2O，分析纯)，由上海中试化工总公司扬州沪宝化学试剂有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 试验设计及管理试验前在实验室暂养8 d，暂养期间连续充气，每天定时喂食1次，换水量为1/3，养殖用水为曝气24 h的自来水。暂养结束后挑选附肢齐全、健康的个体作为试验虾。

参考已有研究报道的安全浓度［7-8］确定本试验中溶液的浓度，按照等对数间距设置浓度梯度，Cu(Ⅱ)的浓度设为 0.055、0.28、1.38、6.88、34.38 mg/L，Cd(Ⅱ)的浓度设为 0.0048、0.024、0.120、0.60、3.00 mg/L，同时设1 个对照组，每组设3个平行。每个水族箱 (100 cm×60 cm×80 cm)中加入试验溶液10 L，放入8只虾。试验期间不投喂，连续充气，每24 h换液一次，水温为(19±1)℃，没有虾死亡。试验时间为96 h，取肌肉、肝胰腺置于-20℃下保存备用。

1.2.2 指标的测定碱性磷酸酶 (AKP)、酸性磷酸酶 (ACP)、谷草转氨酶 (GOT)、谷丙转氨酶(GPT)、蛋白含量均采用南京建成试剂盒测定，具体测定方法参照说明书进行。

1.3 数据统计

原始数据经Excel 2003初步整理后，用SPSS 16.0统计软件进行方差分析，如差异显著，采用LSD法进行多重比较。试验结果用平均数±标准误表示。

2 结果

2.1 Cd(Ⅱ)对克氏原螯虾代谢酶的影响

本试验结果表明，克氏原螯虾的ACP、AKP活性存在组织差异，肝胰腺酶活性高于肌肉。克氏原螯虾暴露于不同浓度的Cd(Ⅱ)溶液后，其肝胰腺中ACP、AKP、GOT、GPT活性和肌肉中 ACP、AKP活性的变化趋势基本相同，均随Cd(Ⅱ)浓度的升高呈先升高后降低的趋势 (图1)。

从图 1可见:肝胰腺中 ACP、AKP、GOT、GPT活性均在Cd(Ⅱ)浓度为0.12 mg/L时达到最大，分别比对照组显著升高了58.83%、86.17%、85.66%、70.98%(P＜0.05);在 Cd(Ⅱ)浓度为3 mg/L时，ACP活性较对照组降低了 48.59%(P＜0.05)，而 AKP、GOT、GPT 活性则与对照组无显著差异 (P＞0.05)。

从图1可见:肌肉中ACP、AKP活性分别在Cd(Ⅱ)浓度为 0.60 mg/L、0.12 mg/L 时最高;ACP活性除最低浓度组 (0.0048 mg/L)外，在浓度为0.024、0.12、0.6、3 mg/L 时分别较对照组显著升高了 162.79%、207.36%、224.42% 和94.57%(P＜0.05)。

2.2 Cu(Ⅱ)对克氏原螯虾代谢酶的影响

同Cd(Ⅱ)对克氏原螯虾代谢酶的影响类似，克氏原螯虾肝胰腺中ACP、AKP、GOT、GPT活性和肌肉中AKP活性均随Cu(Ⅱ)浓度的增大呈先升高后降低的趋势 (图2)。

图1 Cd(Ⅱ)对克氏原螯虾酸性磷酸酶 (ACP)、碱性磷酸酶 (AKP)、谷草转氨酶 (GOT)、谷丙转氨酶 (GPT)的影响Fig.1 Effect of Cd(Ⅱ)on activifies of acid phosphatase，alkaline phosphatase，glutamic－oxalacetic transaminase and glutamic－pyruvic transaminase in red swamp crayfish Procambarus clarkii

从图2可见:肝胰腺中 ACP、AKP活性在Cu(Ⅱ)浓度为0.28 mg/L时均达最大，分别比对照组显著提高了 112.53% 和 94.98%(P＜0.05);GOT、GPT活性在Cu(Ⅱ)浓度为6.88 mg/L时达到最大，其中GOT较对照组显著提高了120.22%(P＜0.05)。

图2 Cu(Ⅱ)对克氏原螯虾酸性磷酸酶 (ACP)、碱性磷酸酶 (AKP)、谷草转氨酶 (GOT)、谷丙转氨酶 (GPT)的影响Fig.2 Effect of Cu(Ⅱ)on activifies acid phosphatase，alkaline phosphatase，glutamic － oxalacetic transaminase and glutamic－pyruvic transaminase in red swamp crayfish Procambarus clarkii

肌肉中ACP活性随Cu(Ⅱ)浓度的增大呈上升趋势，在浓度为0.055、0.28、1.38、6.88、34.38 mg/L时分别比对照组显著升高了 161.63%、147.29%、242.25%、182.17% 和 214.34% (P＜0.05);AKP 活性在 Cu(Ⅱ)浓度为 1.38 mg/L 时达最大，较对照组显著升高了 171.97% (P＜0.05)。

3 讨论

代谢抑制是重金属对水生生物的致毒机制之一。窦亚卿等［9］的研究表明，Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ)能明显抑制日本新糠虾Neomysis japonica体内ACP和AKP的活力。高浓度镉离子使罗非鱼Tilapia nilotica肝脏、心脏和鳃中的乳酸脱氢酶 (LDH)、丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶活性显著下降，暴露于低浓度镉中，罗非鱼LDH在后期显著升高［3］。杨志彪等［10］研究发现，低浓度铜离子对中华绒螯蟹 Eriocheir sinensis肝胰腺和血淋巴中ACP活性具有诱导作用，而高浓度铜离子 (5 mg/L)具有抑制作用。与其相似，本研究结果表明，当Cu(Ⅱ)浓度为0.28 mg/L、Cd(Ⅱ)浓度为0.12 mg/L时，克氏原螯虾肝胰腺中ACP、AKP的活性最高，此浓度与这两种离子对克氏原螯虾的安全浓度较为接近［8］，说明低浓度Cu(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)对克氏原螯虾ACP、AKP活性有诱导作用。尽管Cu(Ⅱ)、Cd(Ⅱ)对ACP、AKP活性均表现出诱导效应，但其作用机制可能不同。铜是机体的必需微量元素，不仅是虾类血氧蛋白的中心原子，还是细胞色素氧化酶、酪氨酸酶、过氧物歧化酶等许多酶类的重要组成部分。杨志彪等［10］认为，低浓度铜离子对中华绒螯蟹AKP的诱导作用可能是由于铜离子取代了AKP酶活性中心的锌离子，从而激活其活性，而当铜离子浓度增加时，锌离子已被完全置换出来，多余铜离子就会结合到酶的去活性位置上，以致酶的活力受到抑制。Cd是机体的非必需元素，水体中低剂量的镉离子通过鳃进入体内后，动物机体可产生大量热休克蛋白、金属硫蛋白(MT)等大分子应激蛋白，由于能量供应和应激分子的合成加强，通常表现为兴奋效应。暴露于高浓度镉离子中时，动物体内的氧化分解供应能力降低，表现为抑制效应。Cattani等［11］研究了镉对舌齿鲈Dicentrarchus labrax代谢的影响，舌齿鲈在浓度为0.5 mg/L和5.0 mg/L Cd(Ⅱ)中暴露4 h后，肝糖原迅速分解，肌肉中游离葡萄糖浓度迅速升高，同时在肝脏中大量诱导合成MT。本试验中设置的最高 Cu(Ⅱ)浓度为34.8 mg/L，除肌肉中ACP活性显著升高外，其他代谢酶的活性均处于与对照组无显著差异的水平，说明克氏原螯虾对Cu(Ⅱ)有较强的耐受能力［7］。当 Cd(Ⅱ)浓度为3.0 mg/L时，克氏原螯虾肝胰腺中ACP活性受到显著抑制，而十倍于Cd(Ⅱ)的Cu(Ⅱ)浓度未明显抑制其代谢酶活性，也说明Cd(Ⅱ)较Cu(Ⅱ)对克氏原螯虾有更大的毒性。

代谢酶活性存在组织特异性。肝胰腺作为解毒器官和脂肪代谢场所，其水解酶类AKP、ACP含量较为丰富。本试验结果也表明，肝胰腺中ACP、AKP活性皆高于肌肉的。重金属对不同代谢酶的影响亦不同。李少菁等［12］研究发现，日本对虾Peneaus japonicus暴露于Zn(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)中后，其AKP、GPT、GOT活性受到抑制，且抑制作用随离子浓度的增大而增强，这3种离子对ACP活性具有诱导作用，而且ACP活性随离子浓度的增大而增强。本试验中，克氏原螯虾肌肉中ACP、AKP活性和肝胰腺中AKP、ACP、GOP、GPT活性均随Cd离子浓度的增大而先升后降，而肌肉中ACP活性除Cd离子浓度为0.0048 mg/L外，其余各浓度均表现出显著的诱导效应。

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