染料木黄酮抑制血管内皮生长因子诱导的血管内皮细胞活化及蛋白激酶K活性

韩彬，程道梅，余小平＊，彭晓莉，贾皓

（1.遵义医学院公共卫生学院，贵州 遵义 563003；2.成都医学院公共卫生系，四川 成都 610083）

血管生成对实体瘤的生长、浸润和转移至关重要，血管内皮细胞（ECs）的活化和肿瘤细胞直接参与 实 体 肿 瘤 的 血 管 生 成［1－3］。 染 料 木 黄 酮（genistein，Gen）是一种重要的非营养素，属于异黄酮类，主要存在于大豆及其制品中。目前，针对Gen的功效研究主要集中于肿瘤、心血管疾病和女性绝经综合征的化学预防［4］。前期研究显示，Gen在体内外均可通过抑制HER－2／neu受体磷酸化和蛋白激酶K（PTK）活性［5］下调促血管生成因子的表达，但有关Gen抗血管生成作用的分子机制仍不十分清楚。ECs参与实体肿瘤的血管生成［6］，本研究旨在评估Gen对血管内皮生长因子（VEGF）诱导的ECs活化的影响，揭示Gen抗血管生成的可能分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

染料木黄酮、VEGF购自北京Yahui生物医学工程公司；PTK活性分析试剂盒、Caspase－3活性分析试剂盒、Annexin V－FITC凋亡试剂盒购自美国Promega公司；特级胎牛血清购自Hyclone公司；ECs生长添加剂ECGS、抗体F－3520购自美国Sigma公司；RPMI 1640培养基购自美国Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）培养和处理收集健康非异常妊娠母亲经阴道所产健康胎儿的新鲜脐带，分离 HUVECs，在含有20%特级胎牛血清、100U／ml盘 尼 西 林、100μg／ml链 霉 素 和75μg／ml ECGS的RPMI1640培养液中，37℃，5%CO2条件下培养。根据鹅卵石样形态以及免疫细胞化学方法（ECs特异抗体，F－3520）鉴定为ECs。将第3～6代的细胞接种于24孔板，分别用5μg／ml VEGF单独处理或VEGF（5μg／ml）外加1、10、100μmol／L Gen处理24h。用等量的二甲基亚枫（DMSO）替代VEGF和（或）Gen处理作为对照组。细胞培养基中DMSO的终浓度≤0.1%（v／v）。

1.2.2 细胞凋亡和死亡分析 采用Caspase－3活性分析试剂盒和Annexin V－FITC凋亡试剂盒对凋亡情况进行定量分析，通过锥虫蓝不相容试验对HUVECs的细胞毒性和死亡情况进行量化分析。

1.2.3 PTK活性分析 将HUVECs在蛋白缓冲液中4℃下溶解20min。缓冲液组成：1%Triton X－100、0.32mol／L 蔗 糖、5mmol／L 乙 二 胺 四 乙 酸（EDTA）、1mmol／L 苯 甲 基 磺 酰 氟 （PMSF）、1μg／ml抑肽酶、2mmol／L 二硫苏 糖醇 （DTT）、10mmol／L Tris－Cl、pH 8.0。采用 Bradford方法测定蛋白的总浓度，严格按照PTK活性分析试剂盒说明书操作测定PTK活性，结果表示为pmol／min／μg蛋白。

2 结果

2.1 Gen诱导VEGF处理的内皮细胞凋亡和死亡

VEGF单独使用或与DMSO联合使用处理HUVECs 24h，其凋亡细胞死亡情况没有明显差异（图1）。与对照组相比，1μmol／L Gen处理组的ECs凋亡率（图1A）和Caspase－3活力（图1B）分别增加了1.81和1.72倍，与VEGF处理组相比，两者分别增加了2.01和2.02倍。Gen处理导致凋亡率（图1A）和Caspese－3活力（图1B）呈剂量依赖型提高，提示Gen可诱导ECs凋亡，锥虫蓝法分析ECs死亡情况也得到相似的结果。Gen处理的HUVECs死 亡 率 从 （4.42±0.98）% 提 高 到（11.35±1.52）%，而 VEGF处理的 HUVECs死亡率未见提高（图1C）。

2.2 Gen抑制VEGF处理的内皮细胞的PTK活性

已有研究报道，Gen对PTK活性有较强的抑制作用［4，7］。为检测Gen对ECs中PTK活性是否有抑制作用，实验将5μg／L VEGF单独使用或将其与Gen（1、10、100μmol／L）联合使用处理HUVECs 24h后，用PTK活性分析试剂检测PTK活性。结果显示，与对照组相比，单用VEGF能使PTK基础活性提高1.3倍，1μmol／L Gen处理的ECs中，PTK活性分别较对照组下降0.82倍，较VEGF处理组下降0.65倍。添加Gen（1～100μmol／L）以剂量依赖方式降低HUVECs中PTK活性，提示Gen可抑制内皮细胞的PTK活性。

3 讨论

本研究的主要结果显示，Gen作为强效的PTK抑制剂［7］，抑制VEGF诱导的内皮细胞活化，这可能是Gen抗血管生成作用的可能机制之一。异黄酮作为大豆中的非营养素成分，广泛存在于人类膳食中，如大豆及各种水果蔬菜，因此我们通过植物性膳食即可摄入大量的异黄酮［8，9］。流行病学调查显示，大豆异黄酮在降低亚洲人乳腺癌和前列腺癌的发生率中发挥重要作用［4，10］。Gen（4，5，7三羟异黄酮）为大豆产品中主要的异黄酮，在动物模型中能够抑制癌症发生［11］。新近文献报道，Gen对人类癌症细胞生长的抑制作用是通过调节与细胞周期和凋亡有关的基因来实现的［12－14］。

体内和体外试验研究表明，Gen是一种有潜力的用于癌症化学预防的物质，因其具有抗辐射和抗肿瘤耐药性而可用于癌症的辅助治疗［4］。前期的研究发现，Gen作为强效的PTK活性抑制剂，可以在转录和翻译水平下调促血管生成因子VEGF、MMPs，uPA 的表达［5］，提示 Gen可能还有许多尚未被发现的病理生理功能。大量研究证实，实体瘤中的肿瘤血管生成是一个复杂、有序的过程，包括促血管生成因子和抗血管生成因子之间的平衡［15－17］。而VEGF在实体瘤的生长、浸润和转移过程中发挥重要作用，尽管这一相互作用在一些特定肿瘤细胞类型的不同生长阶段表现出显著的差异性［18］。然而有关VEGF对ECs，尤其是对HUVECs中的信号通路的影响少有报道。正常成人的血管ECs是高度分化、相对静止的。其活化和增殖是血管生成的起始阶段。本研究明确显示，HUVECs经VEGF处理后，内皮细胞PTK活性提高，进而可能引起下游增殖信号分子的活化及磷酸化并促进内皮细胞增殖。Gen处理以剂量依赖方式降低VEGF诱导的HUVECs PTK活性，升高凋亡率及蛋白激酶－3活性。本研究结果提示，Gen可抑制内皮细胞中的PTK活性，该结果与 Yoon等［19］发现 Gen作为PTK活性抑制剂抑制增殖活性及引起凋亡的假说一致。综合显示Gen具有抗血管生成作用，为其用于肿瘤转移及其他血管增生性疾病的治疗提供了新的思路。

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