高效液相色谱法测定银翘解毒颗粒中绿原酸含量

冯 兵，钱 妍

(1.重庆市急救医疗中心药剂科，重庆 400014;2.重庆医科大学第二附属医院药剂科，重庆 400010)

银翘解毒颗粒由金银花、连翘、牛蒡子等9味中药组方，具有疏风解表、清热解毒的功效，用于治疗风热感冒、发热头痛、咳嗽、口干、咽喉疼痛，临床疗效良好[1]。其质量标准中有荆芥、连翘、牛蒡子的薄层色谱鉴别项，但没有含量测定的要求。笔者建立了测定金银花活性成分绿原酸含量的高效液相色谱法，结果满意，可为进一步提高银翘解毒颗粒的质量标准提供参考。

1 仪器与试药

Agilent 1200型高效液相色谱仪;BP 211D型电子天平(德国Sartorius);SB 2200型超声波发生器(必能信超声有限公司)。绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号为110753-200413);银翘解毒颗粒(太极集团重庆桐君阁药业有限公司，批号为10010001，10030002，10040005);乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Kromasil KR100-5C 柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:乙腈-0.4%磷酸溶液(11∶89);柱温:25℃;检测波长:327 nm;进样量:10 μL。理论板数按绿原酸峰计算应不低于5 000。

2.2 溶液制备

取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加80%甲醇溶液制成每1 mL含26 μg的溶液，作为对照品溶液。取本品0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，称定质量，超声处理(功率250 W，频率45 kHz)30 min，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。取银翘解毒颗粒处方中除金银花外的其余药材，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性考察:取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液，依法进样测定。结果阴性对照品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上基本无干扰，色谱图见图1。

线性关系考察:精密吸取绿原酸对照品溶液(0.025 8 g/L)2.5，5.0，10.0，15.0，20.0 μL，注入液相色谱仪，依法测定，以对照品进样量(μg)为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y=2977.5 X-0.896 6，r=1.0000(n=5)。结果表明，绿原酸进样量在 0.064 5～0.516 0 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

重复性试验:取同一批样品(批号为10040005)6份，依法制备供试品溶液并测定含量。结果绿原酸的平均含量为1.26%，RSD=1.2%(n=6)，表明方法重复性良好。

精密度试验:精密量取同一质量浓度的对照品溶液10 mL，加水稀释至刻度，摇匀，连续进样测定。结果的 RSD=1.1%(n=5)，表明仪器精密度良好。

加样回收试验:取同一批已知含量的样品(批号为10040005，含量3.21 mg/g)，每份约0.20 g，共7份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入已稀释的绿原酸对照品溶液(12.644 μg/mL)50 mL，按供试品溶液制备方法制备溶液，依法测定含量，计算回收率。结果见表1。

表1 绿原酸加样回收试验结果(n=7)

稳定性试验:取同一份供试品溶液，分别在 0，2，4，8，12，24 h时依法进样测定。结果的 RSD为0.32%(n=6)，表明供试品溶液自制备后24 h内测定基本稳定。

2.4 样品含量测定

取3批样品，依法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，平行测定3次，取平均值。结果批号为10010001，10030002，10040005的样品中绿原酸含量分别为 3.21，3.24，3.22 mg/g(n=3)。

3 讨论

根据处方，每1 g银翘解毒颗粒含金银花0.536 g。按2005年版《中国药典(一部)》金银花含量测定项下规定，绿原酸的含量限度为不得少于1.5%，推算成品中绿原酸的理论含量应不低于8.04 mg/g。根据3批样品的含量测定结果，绿原酸含量的平均值为3.22 mg/g，成品转移率为40%。考虑绿原酸对光和热不稳定、提取不完全以及保存期等影响因素，成品转移率基本合理。

取对照品溶液，在200～400 nm波长处进行紫外扫描，结果溶液在327 nm波长处有最大吸收，其他成分在该波长处无吸收干扰，故选择测定波长为327 nm。在选择绿原酸提取条件时，曾对同一批样品的提取溶液和提取时间进行了考察。结果用50%甲醇与80%甲醇提取效果相当，但采用50%甲醇时供试品溶液过滤困难，故选择80%甲醇为提取溶剂;超声处理30 min比10 min和20 min提取完全，效果更好。曾参考文献[2-3]，分别选用甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(15∶85∶1∶0.3)、甲醇-水-磷酸(28∶72∶0.1)、乙腈-0.4%磷酸溶液(8∶92)、乙腈-0.2%磷酸溶液(12∶88)为流动相进行试验，根据分离情况，最后选择乙腈-0.4%磷酸溶液(11∶89)为流动相，可使绿原酸与其他成分很好地分离，且阴性对照无干扰。

试验过程中发现，绿原酸遇光、热有分解现象，应采用棕色瓶贮存并及时测定配置好溶液的含量，剩余溶液应置40℃冰箱保存备用。

使用本法测定绿原酸含量，样品预处理简单，有效成分分离较好，保留时间适宜，操作方法简单快捷，结果准确可靠。因此，本法可作为银翘解毒颗粒的质量控制方法。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社，2005:602-603.

[2]张 丹，李章万.HPLC测定金银花、茵陈及其10种中成药中绿原酸的含量[J].药物分析杂志，1996，16(2):83.

[3]马 柯.高效液相色谱法测定清咽颗粒中绿原酸的含量[J].中南药学，2006，4(6):451-453.