大鼠胫前肌和比目鱼肌生后增龄的分析

王康乐,陈佩林,马以桐,叶 辉,印庆艳,朱道立

(南通大学生命科学学院,江苏南通226019)

骨骼肌是一个非均质组织,存在功能多样性是由于肌球蛋白存在多种亚型。肌球蛋白是热休克蛋白,由2个重链(MHC)和4个轻链(MLC)组成 。肌球蛋白头部重链在N-末端包含大量球状的水解ATP动力结构域和一个形成细丝的棒状C-末端。肌球蛋白的这些部分被一个8.5 nm长的α-螺旋连接,称为“肌球蛋白的颈部”,颈部与一个碱性的和一个调控的MLC相关联。慢缩纤维通常含有碱性慢型MLC的亚型MLC1s和调控MLC的亚型MLC2s。同样,快缩纤维通常含有碱性快型 MLC的亚型MLC1f与不同比例的M LC3f及调控MLC的异构体MLC2f。然而,IIA型纤维通常也包含慢型MLC的亚型。我们应用解剖法结合电生理、SDH酶组化和SDS-PAGE电泳[1-2],以生后各年龄组大鼠快肌代表胫前肌和慢肌代表比目鱼肌为对象,观察不同发育阶段肌纤维改变,以期对快慢肌相互作用原理及其运动机制有所了解。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)主要仪器设备:RM6240多道生理信号系统(成都仪器厂);恒冷切片箱(Leica CM3000型,德国产)、DYY-Ⅲ28C 型电泳槽(北京六一厂)、DYY605稳压稳流电泳仪(南京新校园生物技术研究所)。(2)主要试剂药品:氯化硝基四氮唑蓝、琥珀酸脱氢酶(SDH)为Sigma公司产品,丙烯酰胺(分析纯),N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(分析纯),十二烷基磺酸钠(SDS),三(羟甲基)氨基甲烷(T ris)(优级纯),2-巯基乙醇(2-Mercaptoethanol)(中国医药集团上海化学试剂公司)。

1.2 方法

1.2.1 电生理 生后2周、6周、12周健康SD(rattus norvegicus sprague-dawley)大鼠各6只,雌雄不拘(由南通大学实验动物中心提供),以20%氨基甲酸乙酯(乌拉糖)经腹腔注射麻醉(1 g/kg体重),剖检右后肢,用双电极分别插入胫前肌和比目鱼肌,肌电参数为电压强度:0.1 V,波宽:0.2 ms,频率:2.5 Hz,正电压连续单刺激。

1.2.2 肌肉蛋白质电泳 分别取出胫前肌和比目鱼肌,迅速置于研钵中,加以液氮(-196℃)研磨成粉状,加样品缓冲液(15 mg/mL)溶解,放入高速冷冻离心机中,12 000 r/min(4℃)离心5 min,取上清。

配制4%浓缩胶和8%分离胶,适当加入40%过硫酸铵与TEMED,依次制胶、加样与电泳。预电泳控制电压70～80 V,时间 30～60 min;然后电泳控制电压150 V,时间240～300 min。接着实施银染 、拍照 。

1.2.3 酶组化 从液氮内取出肌条置放于恒冷切片箱(Leica CM3000型,德国产),在-20℃条件下切片,厚度为10 μ m。置于室温干燥30～60 min,做琥珀酸脱氢酶(SDH)组化染色。

1.2.4 观察计数与统计 在光镜下观察肌纤维的类型和结构。每张切片随机抽样10个点,放大100倍后计数肌纤维类型,计算各型肌纤维的构成比例。应用SPSS 13.0统计软件进行双因素方差分析。

2 结果

2.1 大鼠各年龄组胫前肌和比目鱼肌肌电图(electromyogram,EMG)分析 本试验采用针电极分别插入胫前肌和比目鱼肌,引导并记录各肌电图(见图1,2所示)。

随着大鼠年龄增长,肌肉动作电位图谱也不断变化。胫前肌和比目鱼肌的肌电图振幅随年龄的增长,振幅都不断增大,持续时间变长,波动也变大;将胫前肌和比目鱼肌的肌电图相比较,在同一年龄组中胫前肌肌电图的振幅、持续时间均大于比目鱼肌。2.2 大鼠胫前肌和比目鱼肌肌纤维的肌球蛋白轻链异构体(MyLCs)发现胫前肌的电泳图谱上均可分出 5种 MyLCs,即 MyLCs 3,MyLCs 2F,MyLCs 2S,MyLCs 1F,MyLCs 1S的条带,而比目鱼肌的电泳图谱上只能分出 4种MyLCs,即:MyLCs 2F,MyLCs 2S,MyLCs 1F,MyLCs 1S的条带(见图3)。同时胫前肌MLCs 3,MLCs 2F,MLCs 1F的条带要比MLCs 2S和MLCs 1S的深,而比目鱼肌MLCs 2S与MLCs 1S条带要比MLCs 2F,MLCs 1F深,这与酶组织化学染色分型的结果相一致。

表1 生后各年龄组SD大鼠快慢肌肌电图持续时间、波动幅度平均值

2.3 大鼠各年龄组胫前肌、比目鱼肌肌纤维分布在SDH染色切片上,胫前肌的肌纤维可分为I型、IIA型、IIX(IID)型、IIB型。比目鱼肌的肌纤维可分为I型、IIA 型、IIX(IID)型,没有 IIB型 。I型肌纤维细,染色深;IIA型肌纤维中等,染色浅;IIX(IID)型肌纤维最细,染色最深;IIB型肌纤维最粗,染色居最浅(如图4、5所示)。

图3 大鼠比目鱼肌和胫前肌的肌球蛋白轻链异构体银染电泳图

图4 生后各年龄组 SD大鼠比目鱼肌的 SDH组织化学染色生后2周(左),6周(中),12周(右)(400×)

图5 生后各年龄组SD大鼠胫前肌的SDH组织化学染色生后2周(左),6周(中),12周(右)(400×)

表2 大鼠胫前肌和比目鱼肌的肌纤维构成比例%,n=6)

表2 大鼠胫前肌和比目鱼肌的肌纤维构成比例%,n=6)

注:P＜0.05,差异显著

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从表2看出,大鼠胫前肌纤维构成比例在生后发育生长过程中IIB型和IIA型较多,并且IIB型和IIX型肌纤维构成比例随大鼠年龄增长而增加。而比目鱼肌I型和IIA型纤维构成比例较高,这可能和比目鱼肌是后肢重要的维持姿势肌有关。

3 讨论

3.1 肌电图图谱分析 从图1、2中看出,大鼠胫前肌、比目鱼肌在生后不同年龄阶段接受刺激后所产生的动作电位,幼年的波形简单平稳;随着年龄的增加,刺激产生的动作电位波动逐渐变得复杂、持续的时间和频率也较幼年的长,并且12周龄大鼠的棘波清晰可见。重要的是,比目鱼肌动作电位波形比胫前肌的棘波更为复杂。由此可以看出,生后发育过程中大鼠比目鱼肌在稳定体位和调控运动中姿势与关节角度,并选择精致细微动作。本研究发现,当胫前肌作为主动肌疲劳而足背屈运动终止后,其拮抗肌比目鱼肌并没有立即恢复,仍然低于运动前水平[3]。3.2 肌球蛋白轻链异构体的多样性 成年哺乳动物骨骼肌中肌球蛋白轻链异构体(myosin light chain,MyLCs)可以分为6种,即存在于快肌纤维中的MyLCs1f、MyLCs2f以及 MyLCs3f和存在于慢肌纤维中的MyLCs1s、MyLCs2s,还有1种胚胎期MyLCs[4]。我们试验中发现胫前肌的电泳图谱上均可分出 5种 MyLCs,即 MyLCs3,MyLCs2F,MyLCs2S,MyLCs1F,MyLCs1S的条带;而比目鱼肌的电泳图谱上只可分出 4种 MyLCs,即:MyLCs2F,MyLCs2S,MyLCs1F,MyLCs1S的条带,没有MyLCs3。研究证实,在无压力状态下肌纤维的收缩率与MyLCs3的高含量有关,单个个体肌纤维在MyLCs表达上的异质性和MyHCs含量的不同导致肌纤维收缩功能的很大差异。

3.3 肌纤维分布特征 Pette等[5]根据肌球蛋白酶组化分类法将肌纤维分为四型:I(SO)型肌纤维收缩速度慢,肌纤维内琥珀酸脱氢酶活性高,有利于动物维持平衡和姿势;IIX(FO)型肌纤维收缩速度快,易发动而不易疲劳,保持张力和维持姿势的稳定;IIA(FOG)型肌纤维收缩速度相对较快,适合持久快速运动;IIB(FG)型肌纤维收缩时以糖无氧酵解代谢供能为主,易疲劳,产生暴发性短时高张力快速运动[6]。在比目鱼肌切片中未发现有IIB型肌纤维,并且 I型肌纤维47.9%±3.4%～72.3%±6.3%构成比例要明显高于IIA型22.5%±2.5%～38.8%±3.7%和IIX型5.2%±1.7%～13.3%±3.1%纤维,并随年龄逐渐增多,也远远高于胫前肌 I型12.9%±2.3%～20.7%±3.6%纤维,充分说明该肌在小腿三头肌稳定后肢过程中,首先募集I型慢缩氧化肌纤维增加肌力以抵抗重力;而在胫前肌内IIB型41.5%±7.4%～53.7%±8.3%纤维构成随年龄增长,实施无氧酵解高速运动维持后肢的协调运动。

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