钙激活中性蛋白酶-2对肝癌细胞阿霉素耐药性的影响

徐国强，唐佳艳，2，向 敏，3，王 艳，洪 阳，胡晓霞，王旭东，陈腾祥

(贵阳医学院1.生理学教研室、2.附属医院消化内科、3.附属医院儿科，贵州 贵阳 550004，4.贵阳市卫生局，贵州 贵阳 550081)

耐药性是肿瘤复发以及复发后化疗失效的重要原因。肿瘤细胞与正常细胞一样，受到外界刺激后，也可以产生应激性反应，提高其对环境变化的适应性，这是肿瘤细胞对化疗产生耐药性的基本原理［1］。Calpain是一种蛋白质水解酶，其通过有限酶解底物参与许多细胞信号转导通路的活动，发挥多种生物学功能。研究发现［2］，calpain通过酶解细胞周期蛋白E(cyclin E)促进乳腺癌细胞的增殖，提示其是促进肿瘤恶性的重要蛋白，也可能是肿瘤细胞化疗耐药性的机制之一。研究以钙激活中性蛋白酶-2(calpain-2)作为对象，观察其在肝癌细胞中的表达，及其与阿霉素(adriamycin，ADM)耐药之间的关系。

1 材料与方法

1.1药物和试剂Calpain 2 Large Subunit(M-type)Antibody、Cyclin E(HE12)Mouse mAb(美国Cell Signaling Technology公司);calpastatin peptide(美国Merck公司)，DMEM、胎牛血清(FBS)(美国Invitrogen公司);四甲基偶氮唑盐(MTT)、聚丙烯酰胺、双甲叉丙烯酰胺(美国Sigma-Aldrich公司);其它试剂均为进口或国产分析纯。

1.2主要仪器及设备电泳仪及微型垂直电泳槽(美国GE公司)，GBOX iChemiXR化学发光及凝胶成像仪(美国Syngene公司)、epoch微孔板阅读器(美国Biotek公司)，高速冷冻离心机(美国Beckman公司)。

1.3细胞株HepG2细胞株为广州启动子生物科技有限公司冻存，复苏后培养于 DMEM培养液、37℃、体积分数为0.1的FBS和0.05的CO2。

1.4MTT实验收集对数生长期HepG2细胞，以每孔5 000个细胞的密度铺于96孔板中，培养12 h后加入倍比稀释的ADM(每个浓度设5个复孔)。上述条件培养72 h(48 h时换液和补充ADM 1次)。弃培养液，每孔加入 20 μl MTT 溶液(12.1 μmol·L－1)孵育4 h后，加入150 μl二甲基亚砜，微孔板阅读器测各孔的吸光值(OD 490 nm)，计算半数致死量。

按上述方法将HepG2细胞铺至96孔板中，给予ADM(LD50)或calpain-2抑制剂calpastatin peptide(20 nmol·L－1)孵育细胞72 h，如上所述用MTT法检测细胞的成活率。未予ADM和calpastatin peptide处理的HepG2的MTT值作为分母，计算其它组细胞的相对存活率。

1.5Western blotHepG2铺6 cm培养皿，扩大培养至80%的细胞满度，给予ADM(LD50)或20 nmol·L－1calpastatin peptide孵育72 h。洗涤后加入预冷RIPA细胞裂解液［3］，冰上裂解10 min，刮取裂解物，4℃ 12 000 r·min－1离心 30 min，取上清液作为蛋白样品进行Bradford法定量，上样行SDS-PAGE电泳，转印至PVDF膜，室温封闭1 h，4℃ I抗孵育过夜，室温Ⅱ抗(HRP耦合)孵育1 h，加入化学发光试剂，GBOX iChemiXR进行化学发光检测。Gene-Tools软件进行条带分析，用calpain-2或cyclin E条带的灰度值除以内参 β-actin的灰度值，再乘以100%算得calpain-2或cyclin E的相对表达水平。

1.6统计学方法利用SPSS16.0的回归概率模型计算ADM对细胞的半数致死量，对细胞存活率和蛋白质相对表达水平进行方差分析。

2 结果

2.1ADM对细胞的抑制作用及半数致死量ADM对 HepG2细胞具有明显的抑制作用，随着ADM浓度的增大，存活的HepG2细胞数量明显减少，统计计算ADM对HepG2的半数致死量为2.5 μmol·L－1。

2.2ADM对HepG2细胞calpain-2表达及酶解的影响以ADM(2.5 μmol·L－1)处理96孔板中的HepG2细胞不同的时间，结果提示，ADM能够诱导calpain-2表达，但是在短时间(4 h以内)calpain-2的表达没有明显增加，反而略有下降(P＜0.05)，12 h后calpain-2的表达量开始上升(P＜0.05)，48 h后尤其明显(P＜0.01)。伴随着calpain-2的表达量增加，其剪切片段数目也明显增多，而且被剪切的量也增多(P＜0.05)。见Fig 1。

2.3calpain-2活性抑制对ADM作用下的HepG2的存活率的影响及Cyclin E的表达没有ADM作用时，calpain抑制剂calpastatin peptide在72 h内对HepG2 生长没有影响;但是给予 2.5 μmol·L－1ADM处理72 h后，HepG2的存活率下降了(P＜0.05)，而且calpastatin peptide明显使ADM处理的HepG2细胞的存活率更低(P＜0.01)，见Fig 2。

2.4calpain-2活性抑制对ADM作用下的HepG2中的Cyclin E表达及酶解的影响Cyclin E在HepG2中有表达。没有 ADM作用时，calpastatin peptide对cyclin E的表达没有明显的影响，但可以抑制cyclin E的酶解。给予2.5 μmol·L－1ADM 72 h后，cyclin E的酶解成为LMW形式更加明显(P＜0.01)，calpastatin peptide可以明显减少ADM引起的cyclin E的酶解(P＜0.01)。见Fig 3。

Fig 1 The expression and zymohydrolysis of calpain-2 in HepG2 treated with ADM

Fig 2 The effect of calpain-2 inhibitor on the survival rate of HepG2 treated with ADM

Fig 3 The effect of calpain-2 inhibitor on the expression and zymohydrolysis of cyclin E in HepG2 treated with ADM

3 讨论

ADM可干扰转录过程，诱导肿瘤细胞凋亡［4］。然而，癌细胞受到ADM刺激后，会引起应激性的保护:一方面，通过 P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)耐药基因表达上调，减少化疗药物入胞［5］，另一方面，通过细胞周期调节机制减少细胞凋亡［6］。如结果所示，ADM刺激的早期可检测到calpain-2的表达降低，提示在ADM早期应激事件中，calpain-2可能被大量利用并降解减少，而作用一定时间后(大于12 h)，calpain-2的表达增高、酶解程度增强，表明ADM并非直接诱导calpain-2的表达上调和活性增加，而是通过诱导其它基因表达改变后，间接上调calpain-2及其活性，这与Su等［7］报道的应激诱导calpain-2上调和活性有一致性。外源性给予calpain-2抑制剂后，ADM诱导肝癌细胞凋亡的程度增强，表明calpain-2表达和活性增加可使肝癌细胞耐受ADM诱导的凋亡。提示calpain-2可以作为降低肿瘤化疗耐药性的潜在靶点，应予深入研究。

研究发现［8－9］，Calpain-2 可通过酶解 cyclin E参与细胞周期调控，并增加癌细胞的恶性程度［2］。结果提示，ADM可使肝癌细胞中cyclin E被酶解程度增加，而calpain-2抑制剂可逆转ADM引起的cyclin E的酶解，因此表明抑制剂可通过抑制calpain-2活性而减少ADM诱导的cyclin E的酶解。而cyclin E酶解减少可能与肝癌细胞凋亡增加有关，这与Ugland H等的报道一致［10］。至于cyclin E的稳定性增加如何导致癌细胞凋亡增加，还有待进一步研究。

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