不同的脱钙液在骨组织制片中的比较应用

罗灿峤 莫木琼 钟觉民

骨组织是一种坚硬的结缔组织，由骨细胞和骨基质组成，骨基质内含大量无机盐，主要是羟磷灰石-磷酸钙和碳酸钙。由于磷酸钙和碳酸钙的存在造成骨组织的硬度较大，不易切片且极易脱片，因此在病理制片过程中，必须要进行脱钙处理，但如果骨组织脱钙过度又会严重影响组织细胞染色效果，或使组织抗原丢失，从而影响对病变组织的病理诊断或科学实验工作。因此，必须寻找一种合适的脱钙液进行骨组织脱钙。现时的脱钙液有无机酸(硝酸、盐酸、硫酸)和有机酸(蚁酸、醋酸、甲酸等)，也可以利用电解、微波等进行物理脱钙，或混和使用［1］。本研究希望通过对比各种脱钙液的脱钙效果及其后HE染色和免疫组化效果，探讨既方便临床应用，又适合科学研究的脱钙方法。

1 资料与方法

1.1 标本 选取2008年1月至2008年8月我院手术室送检的手术标本50例，其中有长骨、短骨、不规矩骨，包含骨干和骨端的骨皮质、骨髓质。

1.2 材料与设备 所有化学试剂均由广州化学试剂一厂生产;切片机、染色机和切片刀片均由英国shandan公司生产。

1.3 脱钙液的配制 14份浓硝酸加86份自来水配制成14%硝酸;10份浓盐酸加90份自来水配制成10%盐酸;盐酸20 ml，甲酸20 ml，自来水 100 ml，配制成 20% 甲盐酸;EDTA二钠盐10 g，PBS溶液100 ml(滴加NAOH溶液至溶解，然后用HCL中和至pH 7.0)配制成EDTA脱钙液。

1.4 步骤 每例标本平均分成4份，确保所有骨组织的性质都一样。新鲜骨组织及时用10%中性福尔马林水溶液固定。充分固定后，用锋利的钢锯将骨组织切成小块，大小约1.5 cm×1.5 cm×0.3～0.5 cm，厚0.3 cm～0.5 cm，然后充分浸泡在不同脱钙液中，间隔一定时间后更换脱钙液，当用缝衣针顺利穿过无阻力感、手术刀可顺利切开即为脱钙成功。继而进行常规脱水、石蜡包埋、HE染色。

2 结果

2.1 脱钙效果 14%硝酸最好。14%硝酸＞10%盐酸＞20%甲盐酸＞EDTA脱钙液(见表1)。

2.2 脱钙时间 14%硝酸时间最短。14%硝酸＞10%盐酸＞20%甲盐酸＞EDTA脱钙液(见表1)。

2.3 对组织损伤 EDTA脱钙液对骨组织的损伤最小，对组织损伤:EDTA脱钙液＜10%盐酸＜20%甲盐酸＜14%硝酸(见表1)。

2.4 切片质量 14%硝酸切片质量最好。EDTA脱钙液切片质量最差，骨组织中钙盐残存，出现“返砂”现象，切片在镜下或肉眼可见非常明显的“刀痕”现象，甚至影响观察(见表1)。

表1 4种脱钙液效果比较

2.5 脱钙后HE染色的效果 10%盐酸脱钙后HE染色的效果最好，细胞核与细胞质层次分明，对比清晰，颜色鲜艳。其余脱钙后HE染色的效果14%硝酸＜20%甲盐酸＜EDTA脱钙液(见图1)。

图1 A.14%硝酸;B.10%盐酸;C.20%甲盐酸;D.EDTA脱钙液

3 讨论

脱钙是骨组织制片中的重要一环，也是病理技术难点，而脱钙剂的选择尤其重要。

14%硝酸脱钙液是目前临床使用最广的一种脱钙液，主要是因为其脱钙能力最强，脱钙时间最短，但这也使得骨组织的脱钙程度较难掌握，往往造成过度脱钙。同时，14%硝酸的渗透能力差，对骨组织特别是比较硬的骨组织渗透能力更差，导致其对不同组织的渗透程度不相同，脱钙效果不一样，部分标本出现“返砂”现象，制片易出现明显“刀痕”现象，影响观察。另外，14%硝酸脱钙液对组织的损伤最大，脱钙后组织肿胀明显，组织细胞的形态结构难以保持完整清晰。由于14%硝酸为强酸，脱钙后细胞核的染色能力下降，切片经常规HE染色后细胞核着色能力下降而返蓝困难而变成淡红色，对比度差。此外，强酸在溶解骨组织钙盐的同时也容易破坏抗原物质，使得抗原的免疫活性降低，在免疫组化染色中抗原不能有效表达，往往造成假阴性。

10%盐酸脱钙液处理后的骨组织软硬适中，脱钙充分，常规脱水包埋切片无龟裂，刀痕少，无“返砂”现象，切面光滑无皱缩脱落;HE染色后在光学显微镜下观察苏木素、伊红现象色对比清晰，染色均匀无发白，细胞核无皱缩和肿胀变形;但脱钙时间较长，对于比较硬的组织脱钙时间会更长，限制其临床应用。

20%甲盐酸脱钙液的酸性较温和，脱钙彻底干净，对组织损伤性少，脱钙后组织不变色仍保持组织原来的光泽。脱钙效率显著提高，制作出的切片用于HE染色及免疫组织化学研究，都能得到优良效果，免疫组织化学染色能理想地显示抗原物质，免疫组化阳性反应物为棕黄色，定位明确，组织切片背景干净。

由于EDTA是一种优良的脱钙螯合剂，故EDTA脱钙液的脱钙作用优于酸性溶液，对组织破坏极小，能保持组织细胞的完整结构，尤其细胞显微化学改变甚微，且能保存组织中的抗原物质和某些酶类的活性，有利于组织免疫组化和组织化学染色，从而更进一步地保证了实验结果的精确性［2］。EDTA脱钙液脱钙作用较缓慢，一般要4～5周，大多要5～6周，脱钙温度以常温为宜，可加温至37°C快速脱钙，但脱钙效果不理想［3］。另外，EDTA脱钙液在使用过程中还需注意不宜用金属容器，尽量用玻璃容器;同时，组织经过脱钙后必须在流动的自来水充分冲洗，自来水的弱碱性可中和残留在组织中的脱钙液酸性，有利于组织切片苏木素的着色，同时由于脱钙对组织细胞或多或少都有影响，苏木素染色可以适当延长时间以保证苏木素着色。

［1］ 王伯云，李玉松，黄高升，等．病理学技术．北京;人民卫生出版社，2000:943．

［2］ 刘大维，初同伟，张良，等．EDTA微波脱钙骨的免疫组化染色．第三军医大学学报，2003，25(1):77-78．

［3］ 黄美雅，黄云梅，林燕萍，郑良朴．EDTA脱钙方法的实验观察．福建中医药，2007，38(4):46-47．