核因子-κB和p38丝裂原活化蛋白激酶调节脂多糖诱导的气道上皮细胞白细胞介素8的表达

李亚清，严建平，许武林，王 宏

(浙江省人民医院呼吸内科，浙江杭州 310014)

Toll样受体 4(toll-like receptor 4，TLR-4)是先天性防御机制对抗感染的关键成分，在呼吸系统防御病原体及有害颗粒损伤中起着中心性保护作用［1］。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)级联反应是细胞内重要的信号传导系统之一。目前在哺乳动物体内鉴定出的MAPK亚家族包括C-Jun N末端激酶/应激活化蛋白激酶(JNKs/SAPKs)、细胞外信号调节蛋白激酶(ERKs)、ERK5/大丝裂素活化蛋白激酶 1(BMK1)及 p38 MAPK等，其中p38信号途径是MAPK家族的重要组成部分［2］。但p38 MAPK信号通路在气道上皮细胞表达IL-8中的作用仍存在争议［3-4］。因此，本研究通过LPS刺激正常人气道上皮细胞系HBE4-E6/E7，以 TLR4抑制剂 TAK-242、p38 MAPK抑制剂SB202190、NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)预处理细胞，探讨TLR4、p38 MAPK、NF-κB在气道上皮细胞IL-8表达中的作用。

1 材料与方法

1.1主要材料正常人气道上皮细胞系HBE4-E6/E7购自美国ATCC公司。胎牛血清购自美国Giboc公司。TRIzol试剂购自上海华舜公司，Taq DNA聚合酶购自北京天为时代公司。LPS(来源于E.coli0111:B4)、NF-κB 抑制剂PDTC 购自美国Sigma公司。TLR4抑制剂TAK-242购自日本TaKeDa制药有限公司，p38 MAPK抑制剂SB202190购自德国Merck Calbiochem公司。M-MLV逆转录酶购自美国Promega公司;人IL-8 ELISA试剂盒购自德国R＆D Systems。NE-PER细胞核和细胞质蛋白质提出试剂盒及LightShiftTM Chemiluminescent EMSA试剂盒购自美国Pierce公司。

1.2细胞培养与分组HBE4-E6/E7细胞复苏后用含10%胎牛血清、105U·L-1青霉素、100 mg·L-1链霉素DMEM/F12培养液混悬细胞，在37℃、5%CO2条件下培养2.5 h，调整细胞浓度约为1×109·L-1，进一步培养。量效实验:将HBE4-E6/E7细胞分成5 组，分别加入终浓度为0、0.1、1、10、100 μg·L-1LPS，在 37℃、5%CO2条件下培养 24 h。时效实验:将HBE4-E6/E7细胞分成5组，第1组未用LPS刺激，第2～5组加入终浓度为10 μg·L-1LPS，在 37℃、5%CO2条件下分别培养 8、12、16、24 h。细胞信号转导实验:将 HBE4-E6/E7分成5组，第3、4、5 组分别加入 100 μg·L-1TAK-242、50 mg·L-1PDTC、10 mg·L-1SB202190 预处理 30 min，接着第2、3、4、5 组分别加入终浓度为100 μg·L-1LPS刺激24h，第1组未用LPS刺激。收集细胞及上清液，-80℃保存。

1.3逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以TRIzol提出总RNA。按MMLV逆转录酶试剂盒说明合成cDNA。按Taq酶说明合成目的基因。PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，用UVP-GDS8000凝胶成像分析系统拍照、图像灰度分析，将目的基因扩增片段灰密度值与内参照β-actin扩增片段灰密度值的比值作为目的基因mRNA表达的定量指标。引物由北京奥科生物科技公司合成:IL-8(Genebank:NM_000584)上游 5'-GTCTGCTAGCCAGGATCCAC-3'，下 游 5'-ACACAGCTGGCAATGACAAG-3'， 产 物498bp。β-actin 上 游 5'-GGCACCACACCTTCTACAATGA-3'，下 游 5'-TCAGGAGGAGCAGCAATGATCTTG-3'，产物 745bp。

1.4酶联免疫吸附试验(ELISA)收集细胞上清液，2 000 r·min-1离心 5 min，弃沉淀，以 ELISA 法检测细胞上清液中的IL-8浓度。根据IL-8 ELISA试剂盒说明书操作。

1.5凝胶阻滞分析实验(EMSA)用NE-PER细胞核和细胞质蛋白质提出试剂盒提出细胞核蛋白，按试剂盒说明操作。由北京奥科生物科技公司设计、合成NF-κB双链寡核甘酸探针。生物素标记NF-κB探针序列，x代表生物素:5'-xGCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3'(a)，5'-xAGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'(b)。未用生物素标记NF-κB探针序列:5'-GCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3'(a)，5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'(b)。以LightShiftTMChemiluminescent EMSA试剂盒检测NF-κB活性，步骤如下:制备5%非变性聚丙烯酰胺凝胶，100 V 预电泳 30 min，室温孵育含 50 μg·L-1Poly(dI·dC)、0.05%NP-40、50 mmol·L-1KCl、5 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1EDTA 的结合反应体系20 min 后，加入5 μl的5 × loading buffer，混匀，上样，100 V电泳，380 mA电转移1 h。将膜置于干燥的纸上(有溴酚兰面朝上)1 min，紫外交联10 min。以ECL方法显影，用UVP-GDS8000凝胶成像分析系统扫描、分析条带灰密度值。

1.6统计学方法采用SPSS 11.5统计软件包进行统计学分析，实验数据以±s表示，统计学分析采用配对t检验和单因素方差分析(组间差异用F检验，组间两两比较用q检验)。

2 结果

2.1LPS对HBE4-E6/E7细胞IL-8 mRNA表达的影响未用LPS刺激时，HBE4-E6/E7细胞的IL-8 mRNA表达水平较低;当以LPS刺激后，HBE4-E6/E7细胞中IL-8 mRNA的表达随着LPS刺激剂量的增加明显增加(P＜0.05，Fig 1);在24 h内，以10 μg·L-1LPS刺激各组细胞，IL-8 mRNA的表达随着刺激时间的延长明显增加(P＜0.05，Fig 1)。

2.2TAK-242、SB202190和PDTC对LPS诱导的IL-8 mRNA和蛋白表达的影响以100 μg·L-1LPS刺激HBE4-E6/E7细胞后，IL-8 mRNA和蛋白表达水平均较刺激前明显增加(P＜0.05，Fig 2、3)。TAK-242、SB202190和PDTC均能明显抑制LPS诱导的HBE4-E6/E7细胞IL-8 mRNA和蛋白的表达(P＜0.05，Fig 2、3)。

2.3TAK-242、SB202190和PDTC对LPS诱导的NF-κB活性的影响以 100 μg·L-1LPS刺激HBE4-E6/E7细胞后，NF-κB的活性明显增加(P＜0.05，Fig 4)。以100 μg·L-1TAK-242、10 mg·L-1SB202190、50 mg·L-1PDTC 和 HBE4-E6/E7预先共孵育30 min，再以100 μg·L-1LPS 刺激，结果表明TAK-242和PDTC均能明显抑制LPS诱导的HBE4-E6/E7细胞 NF-κB 的活性(P＜0.05，Fig 4)，而SB202190不能抑制LPS诱导的NF-κB的活性(P＞0.05，Fig 4)。

Fig 1 Expression of IL-8 mRNA induced by lipopolysaccharide in HBE4-E6/E7 cells(n=8)

3 讨论

LPS是革兰阴性菌细胞壁外膜中的重要成分，能激活淋巴细胞、巨噬细胞等免疫细胞，促进多种细胞因子、趋化因子、黏附分子、酶的生成与释放，是先天性免疫系统强大的刺激因子［5］。气道上皮细胞构成防御病毒、细菌、香烟烟雾等因子损伤气道的天然屏障。本研究表明:HBE4-E6/E7细胞随着LPS刺激剂量增加或时间的延长，其IL-8的表达水平明显增加。而气道局部炎症或免疫刺激信号可进一步影响气道上皮细胞的功能，促进气道炎症的发展［6］。

多种信号分子参与LPS激活效应细胞的过程。在TLR-4介导的依赖分子髓样分化因子88(myeloid differentiation factor，MyD88)的信号转导途径中，LPS在LPS结合蛋白和膜CD14的帮助下与MD-2(myeloid differentiation protein 2)结合，诱导TLR4/MD-2异二聚化，使MyD88和MyD88转接蛋白类似物聚集到TLR4受体复合体。IL-1受体相关激酶(IL-1R associated kinases，IRAK)1和IRAK 4与该受体复合物结合后，IRAK 1发生磷酸化、解离，接着肿瘤坏死因受体相关因子(tumor necrosis factor receptor associate factor，TRAF)6活化。TRAF6可通过以下两条途径进行信号转导:一条是包括Rel家族转录因子NF-κB的途径;另一条是包括p38和JNK途径，激活转录激活因子2、信号转导和转录激活因子等转录因子，参与调控靶基因的表达［7-8］。TAK-242是TLR4选择性的抑制剂［9］。本研究表明:TAK-242能明显抑制LPS诱导的HBE4-E6/E7细胞IL-8的表达、降低LPS诱导的NF-κB的活性。这表明TLR4在LPS诱导的气道上皮细胞IL-8表达的信号通路上游起着的关键性作用。p38 MAPK在细胞核内通过磷酸化作用能激活多种转录因子［2］，但其在气道上皮细胞表达IL-8中的作用报道不一［3-4，10］。PDTC可通过抑制IκBα的降解抑制NF-κB的活性，是NF-κB活化的特异性抑制剂［11］。SB202190是 p38 MAPK特异性的抑制剂［12］。本研究表明:PDTC和SB202190均能明显抑制LPS诱导的HBE4-E6/E7细胞IL-8的表达，但是PDTC能明显抑制LPS诱导的NF-κB的活性，而SB202190不能抑制LPS诱导的NF-κB的活性。这表明SB202190抑制LPS诱导的气道上皮细胞IL-8的表达是不依赖NF-κB信号通路的，NF-κB和p38 MAPK两条信号通路均参与调控TLR4介导的气道上皮细胞IL-8的表达。

Fig 2 Effects of TAK-242，SB202190 and PDTC on IL-8 mRNA expression induced by lipopolysaccharide(n=8)

Fig 3 Effects of TAK-242，SB202190 and PDTC on IL-8 protein expression induced by lipopolysaccharide(n=8)

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