一株锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定

朱 霞，李新伟，王 好，吕文亮，周井祥

(1.吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林 长春 130118；2.吉林农业大学动物科技学院，吉林 长春 130118)

锦鲤疱疹病毒病(Kio herpesvirus disease，KHVD)是由锦鲤疱疹病毒(Kio herpesvirus，KHV)感染引起锦鲤、鲤鱼及其普通变种如框镜鲤等的一种高度传染性、致死性疾病。该病主要发生在春秋季节，水温18℃～28℃易发病，23℃～28℃易暴发流行。但是，目前该病具有在低温下发病的趋势[1]。KHV感染宿主范围狭窄，仅感染锦鲤、鲤鱼及其普通变种，而与鲤鱼种系相近的其他鱼类在适宜温度下也不发病；成鱼和鱼苗均可感染，但成鱼更易感，并且死亡率较高[2]。

KHVD于1998年首次在以色列的Magan Michael地区和美国爆发，病原鉴定为KHV[3]。同年，该病在英国爆发后，几乎蔓延至整个欧洲。2002年4月，印度尼西亚发生KHVD，我国广东省锦鲤也疑似发生该病[4]。同年12月我国台湾省检测到锦鲤感染KHV，韩国和马来西亚也较早发现该病[1,5]。2003年10月首次在日本证实了该病的存在[6]；南非也于2003年报道了该病。由此可见，锦鲤和鲤鱼的国际性贸易以及缺乏相应的检测制度已经导致KHVD呈全球性分布。

2003年以来，我国东北地区的框镜鲤和普通鲤鱼爆发疾病，死亡率高达80%～90%，PCR检测为KHV阳性。KHVD给我国框镜鲤、鲤鱼的养殖业造成严重的经济损失。本研究在国内首次分离获得一株KHV，为预防和控制该病的研究奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 病料样品及实验动物 患病鲤鱼采自辽宁省某渔场，充氧运输至实验室；健康框镜鲤和鲤鱼购自长春市某渔场。

1.2 主要试剂 新生牛血清、M199培养基购自GBICO公司；ExTaqDNA聚合酶、pMD18-T载体均购自TaKaRa公司；E.coliDH5α购自北京全式金生物技术有限公司；DNA胶回收试剂盒购自天跟生化有限公司；质粒小量提取试剂盒购自北京索来宝科技有限公司。

1.3 病毒分离

1.3.1 细胞培养 按照文献[7]和文献[8]的组织块培养法，将无菌处理的框镜鲤尾鳍剪碎成大约1 mm3块，接种于细胞培养瓶，以含20%FCS的M199培养基，26℃5%CO2恒温培养箱中培养，20 d～25 d长满单层。采用胰酶将细胞消化传代，并命名为框镜鲤鱼鳍细胞(KFC)。

1.3.2 病毒的分离 按照文献[9]中方法进行，采取活体患病鱼的肾细胞，制备成悬液与KFC单层细胞在22℃的条件下共培养。逐日观察细胞病变(CPE)，收集CPE达70%～80%的细胞及上清液，保存于-20℃。同时设立不感染细胞对照。

1.4 电镜观察 将反复冻融2次的病毒培养物离心，取沉淀物以0.5%磷钨酸进行常规负染，透射电子显微镜下观察并拍照。

1.5 PCR鉴定及序列分析

1.5.1 引物设计与合成 参考GenBank登录的3个KHV株基因序列，选取保守的ORF25基因，应用primer5.0软件设计引物，P1：5'-GATATCATGTCAT GTTCCATCCGCCA-3'；P2：5'-GAATTCTTAGGTGG CGTTGAGGTC-3'，PCR扩增产物预期为849 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.5.2 病毒DNA的提取与PCR鉴定 将收集的病毒培养物反复冻融2次，碱裂解法提取病毒DNA，并进行PCR扩增。PCR反应条件为：95℃5 min；94℃ 40 s、55℃ 30 s、72℃ 1 min，35个循环；72℃10 min。扩增产物以琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.5.3 目的基因的回收与连接 PCR产物经纯化后连接于pMD18-T载体中，转化E.coliDH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上筛选单菌落，LB培养基中200 r/min振荡培养过夜，提取重组质粒，以EcoRⅠ和EcoRⅤ进行双酶切鉴定。1.5.4 序列比较及进化树绘制 阳性重组质粒由北京六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定。利用DNAStar软件将测序结果与GenBank登录的参考病毒株进行序列同源性分析并构建系统进化树。

1.6 病毒效价测定及动物感染试验

1.6.1 毒价测定 将病毒液进行10倍系列稀释，分别接种96孔板培养的KFC单层细胞，每个稀释度进行8孔重复，22℃吸附1 h后，加入含5%新生牛血清的M199维持液，22℃继续培养，同时设阳性对照孔(未稀释的细胞毒)和阴性对照孔(维持液)，逐日观察记录CPE，采用Karber法计算TCID50效价。

1.6.2 动物感染试验 选用体质量约500 g的健康鲤鱼30尾，实验室饲养观察4周无任何病症。以病毒培养物原液(TCID50效价为10-6.75)腹腔注射途径接种实验鱼20尾，每尾1 mL，维持水温在20℃～24℃；同时设未接种病毒对照鱼10尾。逐日观察试验组的临床症状。由表现临床症状的鱼组织中提取病毒DNA，进行PCR鉴定。取发病鱼鳃和肾脏组织进行病理切片检查。

2 结 果

2.1 病毒分离 将KFC与感染鱼肾细胞共培养，5 d～6 d后出现细胞体积增大及少量的细胞质空泡化，10 d后病变明显，细胞脱落；对照细胞生长良好。当CPE达到70%～80%时收取病毒。病毒分离过程中产生的CPE与Pikarsky等描述一致[10]。将第一代KHV培养物接种健康细胞，3 d～5 d出现典型CPE，7 d～9 d细胞开始脱落(图1)。

2.2 电镜观察 在透射电子显微镜下观察到典型的KHV粒子，病毒直径约为100 nm，二十面体对称，病毒粒子有囊膜，核衣壳表面有螺纹样结构(图2)，与文献描述相符[9]。但本实验电镜观察到某些病毒粒子的囊膜生长不完全，即未成熟病毒。

2.3 PCR鉴定及序列分析

2.3.1 病毒基因的克隆及鉴定 将ORF25基因进行PCR扩增，产物凝胶电泳检测结果显示，扩增出约800 bp的特异性片段(图3)；将其连接至pMD18-T载体中，经EcoRⅠ和EcoRⅤ酶切鉴定，含有目的片段(图3)，与预期相符。

2.3.2 序列测定和分析 将测序结果与GenBank中登录的KHV序列进行比较，结果表明，ORF25基因与参考病毒株KHV-I、KHV-U和KHV-J的同源性均为99.9%。将分离株命名为KHV-cj。氨基酸序列分析表明，KHV-cj存在一个氨基酸位点的突变：第239位E突变为K。氨基酸抗原性分析表明该片段抗原性较好。

2.4 病毒毒价测定及动物感染试验

2.4.1 病毒毒价测定 经检测，KHV-cj第二代细胞培养物的TCID50效价为10-6.75。

2.4.2 实验鱼发病情况 实验鱼感染KHV-cj 4 d～5 d后，表现反应迟钝、食欲不振、皮肤出现灰白色斑点、体表粘液分泌增多、某些病鱼鳍基部及体表出血、随后鳃组织出血、有白色坏死斑，剖检肾脏可见出血点。感染后第8 d开始死亡。在感染后第30 d，发病率为100%(20/20)，死亡率达75%(15/20)。对照鱼无临床症状。

2.4.3 PCR鉴定 采取出现临床症状的实验鱼鳃或肾脏组织，提取核酸，利用ORF25基因引物进行PCR扩增，得到849 bp的特异性目的片段。

2.4.4 病理学变化 采取感染后3 d实验鱼鳃组织，病理切片观察显示：鳃薄片减少，存在炎性细胞浸润；濒死鱼鳃组织表现鳃结构消失、鳃弓内血管充血、鳃耙变细；肾小管周围存在炎性细胞；濒死鱼肾脏出现严重的间质性炎症，并伴随血管充血。

3 讨 论

研究显示，KHV仅在KF-1、普通鲤鱼脑以及原始宿主细胞中增殖[8,11]。Calle等报道利用常用的鱼类细胞系较难分离到KHV，刘荭等也证实KHV无法在CO、CK和EPC鱼类细胞内复制[4]。因此，本研究选择框镜鲤尾鳍传代细胞进行KHV的分离。另外，有报道表明，较难从死亡时间稍长或冻存后的组织中分离到该病毒，而且肾脏是KHV增殖效率最高的器官[10,12]。因此，本研究采用活患病鱼的肾脏组织进行KHV分离，大大提高了病毒的分离几率。

KHV是鱼类疱疹病毒属中基因组最大的病毒，含有156个ORF，其中只有少数已经确定功能，根据Aoki等的报道，ORF25基因编码膜糖蛋白，在KHV的3个分离株中均未发生突变，属于较为保守的基因序列[13]。病毒的膜糖蛋白参与病毒吸附和穿入过程、病毒诱导的细胞融合过程及病毒从核膜出芽、释放过程等[14]。本研究中获得ORF25基因849 bp的部分片段，经氨基酸序列分析表明，有一个氨基酸位点发生突变，而氨基酸的抗原性较好。ORF25基因在体外的表达及其功能还需要进一步研究。另外，KHV-cj引起我国框镜鲤和鲤鱼发病，并且在目前具有低温下发病的趋势，是否与该株病毒某一基因的突变密切相关，以及KHV-cj基因突变是否会引起其他问题等还有待于深入研究。

本研究将具有典型KHVD症状鲤鱼的肾细胞悬液接种于MFC细胞，出现典型的KHV CPE，通过电镜观察、PCR鉴定和序列分析以及动物回归试验，表明已分离到KHV。这是我国首次分离到KHV的报道，为我国展开KHV的分子生物学、流行病学、检测与诊断以及免疫和预防等方面的研究提供了试验材料。

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