退行性心脏瓣膜病患者血清中MHC、IRF-4、HSP70、HSP22 mRNA表达的变化及意义

于智勇 陈月云

老年退行性心脏瓣膜病(SDHVD)又称老年钙化性心脏瓣膜病，是随年龄增长而表现的心脏瓣膜老化、退行性变和钙盐沉积所致的心脏瓣膜病。临床表现为心律失常、心衰、晕厥以及猝死等，随着我国老龄化社会的形成，老年心脏瓣膜病患者也逐渐增多，大多数患者需行心瓣膜置换术治疗，给身心健康带来了巨大的威胁。SDHVD的发病机制还不明确，本研究将通过观察SDHVD患者血清肌球蛋白重链(MHC)、干扰素调节因子-4(IRF-4)、热休克蛋白70(HSP70)、热休克蛋白22(HSP22)mRNA表达水平探讨SDHVD的可能发病机制，并对与心功能的相关性进行分析。

1 对象与方法

1.1 研究对象 根据SDHVD诊断标准［1］，经彩色多普勒超声心动图检查，选择本科室2009年10月至2010年11月SDHVD住院患者65例，其中单纯老年主动脉瓣钙化(AVC组)25例，男18例，女7例，年龄62～87岁，平均(78.36±6.5)岁;单纯老年性二尖瓣钙化(MVC组)19例，男14例，女5例，年龄61～82岁，平均(76.3±5.53)岁;主动脉瓣钙化合并二尖瓣钙化(AVC+MVC组)21例，男15例，女6例，年龄60～91岁，平均(79.28±6.15)岁;另选同期住院非SDHVD患者(对照组)24例，男16例，女8例，年龄63～86岁，平均(77.14±6.2)岁。并排除风湿性、梅毒性、乳头肌功能不全、腱索断裂以及感染性心内膜炎等原因所致的瓣膜病变，并且无先天性结缔组织异常和钙磷代谢异常的疾病或病史。同时利用彩色超声心动图测定左房、左室大小及左室收缩与舒张功能参数。并按NYHA分级评定心功能。

1.2 RT-PCR 取由临床采集患者肝素抗凝血样2 ml，采用Trizol一步法提取总RNA，逆转录成cDNA。取2 μg总RNA作为模板，oligo-dT作引物，逆转录酶为AMV，反应体系为10 μl。MHC引物序列为:上游:5'-GTGCGACAACACTTATGAAA-3'，下 游:5'-AAACAGCCGTCCTGAGAT-3'，退火温度53.7℃，扩增产物长度 317bp;IRF-4引物序列为:上游:5'-TGAGCGAGGGCATAAATACAG-3'， 下 游:5'-CTTCACGCACCATTCAGACAG-3'，退火温度50℃，扩增产物长度307 bp;HSP70上游:5'-CACCACCTACTCCGACAACCA-3'，下 游:5'-GCCCCTAATCTACCTCCTCAATG-3'，退火温度50℃，扩增产物长度647 bp;HSP22上游:5'-CCTTCTCCTGCCACTACCC-3'，下游:5'-TGCCAGACACCTCCACGT-3'，退火温度50℃，扩增产物长度351 bp;甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)上游:5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游:5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'产物长度452 bp。PCR反应条件:94℃(预变性)1 min 1次;94℃(变性)1 min，55℃(退火)30 s，72℃(延伸)30 s共30个循环;72℃(延伸)5 min 1次;即上PCR仪，PCR产物即进行电泳或冻存，MHC循环数30;IRF-4循环数30;HSP70循环数26;HSP22循环数30。

1.3 PCR产物电泳分析 配制1%琼脂糖凝胶，加入终浓度为0.5 μg/ml的溴化乙锭(EB);取5 μl PCR 终产物及DNA marker，以1×TAE为缓冲液，电压80 V，电泳20 min，采用Tanon凝胶成像与分析系统Image System Ver 4.0测定扩增产物条带平均光密度值(图1)。结果以目的基因mRNA与GAPDH mRNA的比值表示，进行半定量比较。

1.4 统计学处理 用SPSS 12.0专业统计软件进行统计分析，记量资料以均数±标准差表示，计数资料以百分比表示;多组间比较用方差分析，率的比较采用χ2检验;相关性研究采用直线相关分析。P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 各组患者基础资料比较 SDHVD瓣膜钙化各组与对照组以及各瓣膜钙化组之间年龄、性别及合并高血压、冠心病、糖尿病均无明显差异(P＞0.05)。瓣膜钙化各组Ⅲ级以上心功能例数与对照组相比差异显著(P＜0.01)，而瓣膜钙化各组之间Ⅲ级以上心功能例数相比无显著差异(P＞0.05)。见表1。

表1 各组患者基础资料比较

2.2 各组患者血清检测指标及心脏结构与功能比较

MVC、AVC、AVC+MVC各组与对照组相比 MHC、IRF-4、HSP70、HSP22、左房内径、左室内径、左室射血分数(LVEF)均有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05);而不同瓣膜钙化各组之间 MHC、IRF-4、HSP70、HSP22、左室内径、LVEF均无统计学意义(P＞0.05)，其中MVC组与AVC组、AVC+MVC组左房内径相比有统计学意义(P＜0.01);MVC、AVC、AVC+MVC和对照组各组之间左室舒张功能参数无统计学意义 (P＞0.05)，经统计学分析，SDHVD患者血清 MHC和IRF-4 mRNA表达量明显降低，HSP70和HSP22 mRNA表达量明显增高，而不同瓣膜钙化损伤间无明显差异。见表2。

表2 各组患者血清检测指标及心脏结构与功能比较(±s)

表2 各组患者血清检测指标及心脏结构与功能比较(±s)

注:与对照组比较，*P＜0.05＊＊P＜0.01;与MVC组比较，△△P＜0.01

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2.3 血清MHC、IRF-4、HSP70、HSP22与心功能相关性分析 SDHVD患者血清MHC、IRF-4与LVEF呈正相关(r分别为0.394、0.427，P ＜0.05)，HSP70、HSP22与LVEF呈负相关(r分别为 －0.409、－0.422，P＜0.05)。

3 讨论

目前国内外研究均认为SDHVD很可能是一种多因素参与、被动和主动交替出现的过程，其病理生理基础包含了基膜破裂、细胞凋亡、巨噬细胞和T淋巴细胞迁移、脂质渗透及钙盐沉积等过程［2］。与高血压、主动脉硬化、冠心病、高胆固醇血症、脑卒中等疾病高度相关，其中以单纯主动脉瓣病变最多见，其次为主动脉瓣合并二尖瓣病变及单纯二尖瓣病变，这可能是随着年龄增长，主动脉瓣和二尖瓣长期承受大的血流冲击，瓣膜机器支架易受破坏，引起瓣膜的纤维化和主动的异位钙化有关［3］。已证实多种介质如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子 1(TGF-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素-1β及基质金属蛋白酶(MMPs)参与瓣膜钙化与狭窄的发生发展过程［4］。

肌球蛋白是将储存在ATP中的化学能转化为机械能的分子马达，与信号传导、肌肉收缩、趋化性迁移和细胞形状的改变等有关［5］。老年人单核细胞肌球蛋白减少，可能影响到免疫细胞的许多功能［6］，例如B细胞分泌抗体的速度，巨噬细胞向炎症部位的移动效率，影响抗原提呈细胞表达MHC分子的效率等等，最终导致衰老免疫功能的低下。

干扰素调节因子(IRF)家族是能对干扰素的基因表达进行调控的一类转录因子，参与炎症反应、细胞周期和细胞凋亡等生物学过程，维持着CD4+T细胞的功能、分化及自稳平衡，对人体免疫功能有着重要的调节作用。随着年龄增长，淋巴细胞中IRF-4减少时，巨噬细胞就会过多地释放前炎症因子［7］，进一步造成细胞的损伤，导致心肌组织自身免疫反应。

HSP70可提高细胞对各种损伤因子的耐受能力，起保护细胞结构和功能的作用。Pantos等［8］通过结扎大鼠左冠状动脉建立心肌梗死模型，发现心肌HSP70的表达能明显提高，并能同时增加心肌对随后的缺血/再灌注的抗性。同时指出，HSP70内源性保护途径可能是通过抗氧化和抗凋亡机制来达到这一目的。

HSP22具有丝/苏氨酸激酶活性，是一种磷蛋白。HSP22不仅有分子伴侣的作用还有抗凋亡的作用［9］，HSP22可激活心肌腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、PI3K/Akt通路、PKCE等抗凋亡、细胞保护、预适应和代谢刺激等存活通路，保护缺血损伤心肌［10］。

本研究发现，SDHVD各组与对照组的MHC、IRF-4、HSP70、HSP22 mRNA表达量相比均有统计学意义，同时还发现SDHVD各组与对照组相比LVEF下降明显，舒张功能参数则无明显差异，SDHVD患者血清MHC、IRF-4的含量与 LVEF呈正相关，HSP70和HSP22 mRNA表达量与LVEF呈负相关。以上结果提示，血清 MHC、IRF-4、HSP70、HSP22 mRNA 表达量和瓣膜钙化关系明显，但和瓣膜钙化发生的部位关系不大，且SDHVD患者心功能失调以收缩功能衰竭为主。

随着人类预期寿命的增长，SDHVD发病率逐渐增高，将成为老年临床心脏病学的一个重要问题，SDHVD应引起临床和基础医学研究者的高度重视，而监测血清 MHC、IRF-4、HSP70、HSP22 mRNA 表达量有助于SDHVD的早期诊断和探讨新的干预措施。

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