浅谈口蹄疫疫苗生产过程中消毒和消毒剂的应用

吴必武

(云南省保山疫苗厂，云南 保山 678000)

口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)感染引起的偶蹄动物共患的一种急性、烈性、接触性传染病。口蹄疫病毒对酸碱都特别敏感，在pH 7.2～7.6时稳定性较强;在低温下十分稳定，但对热敏感;经紫外线照射后，其病毒RNA的尿嘧啶形成二聚物，致使FMDV迅速被灭活;电离辐射也可使病毒灭活;FMDV不含有囊膜，所以对脂溶剂(氯仿、丙酮等)有抵抗力。目前控制和扑灭口蹄疫最有效和最经济的手段是接种安全有效的疫苗。我国主要应用于预防接种的是常规(细胞培养)灭活疫苗。

在疫苗生产过程中消毒与灭菌的方法是否得当，效果是否可靠，是疫苗生产能否顺利进行的重要影响因素。现对口蹄疫疫苗生产过程中消毒与消毒剂的应用、种类及影响因素等方面进行探讨，这对口蹄疫疫苗的规范生产和质量控制具有实用意义。

1 口蹄疫疫苗生产过程常用消毒方法

为了保证细胞培养与病毒接种的正常进行，疫苗生产过程中所用的大量玻璃器皿、橡胶制品、各种溶液、金属器械及洁净工作服均需要消毒灭菌。其中无菌间等生产车间、人员手部以及各种金属器械一般用化学方法或紫外线辐射进行消毒。

1.1 紫外线消毒

紫外线的杀菌波长范围是265～268 nm，它可以引起DNA中形成胸腺嘧啶二聚体，干扰DNA复制，从而导致细菌变异或死亡。紫外线消毒对被消毒物品的损伤小，无残留毒性，且经济方便，对设备要求不高，使用范围广，安全可靠，但紫外线的穿透能力弱，不能通过普通玻璃、尘埃，只能用于消毒物体表面、空气及无菌操作室，也可用于不耐热物品表面消毒。

1.1.1 对空气消毒

对空气消毒的最好方法之一是使用空气过滤和紫外线照射相结合。一般每10～15 m2面积安装30 W紫外线灯管1支，灯管安装于距地面2.0～2.5 m高处，由于空气能自由流动，所以一般都能得到消毒。在室温20～40℃，相对湿度不高于60%时，照射30 min即可达到消毒要求。

1.1.2 对水的消毒

用紫外线消毒水的优点是水中不必添加其它消毒剂或提高温度。紫外线消毒水时，照射剂量要在90 000μW·s/cm2以上，且水层不宜超过2 cm。紫外线在水中穿透力，随深度的增加而降低，如表1。

表1 蒸馏水深度对紫外线穿透的影响

1.1.3 对污染表面的消毒

在无菌间，紫外线等一般安装在层流罩下，灯管功率不少于2W/m2，照射时间为30 min，消毒的有效范围在1.5～2.0 m处，照射剂量要在10 000μW·s/cm2以上。在开始工作和工作完毕后，打开紫外灯，使工作台面完全暴露，照射30 min，可达到消毒目的。使用时应注意要保证足够的辐射强度和足够的照射时间，以确保消毒的效果。

1.2 化学消毒

消毒剂对一切细胞原生质均有毒性，其作用机制有:使菌体蛋白凝固变性;干扰细菌酶的活性，抑制细菌代谢和生长;损害细胞膜的结构，改变其通透性，破坏其生理功能等，从而起到消毒灭菌作用。生产车间常用的化学消毒剂有甲醛、氢氧化钠、新洁尔灭、甲酚皂等。

1.2.1 对无菌间的消毒

每次使用无菌间后，必须用0.2%新洁尔灭溶液、5%甲酚皂溶液擦拭台面及各种器皿，并用上述溶液擦拭地面。新洁尔灭溶液和甲酚皂溶液应交替使用，以防细菌产生抗药性。除此之外，还应定期或不定期的用化学熏蒸法进行消毒，一般每月1次。对无菌间的熏蒸消毒一般采用甲醛熏蒸和过氧乙酸熏蒸，但这两种方法所需熏蒸时间长，均在12～24 h，并且由于熏蒸后消毒剂残留严重，对人体影响较大，消毒后无菌间不能立即使用，影响生产的正常进行，所以在疫苗生产中不常使用，只有在更换病毒血清型时才用。目前通常采用臭氧熏蒸法，该法具有杀菌消毒谱广、杀菌消毒率高、杀毒速度快(比甲醛熏蒸缩短6倍)、安全无残毒等优点，在消毒完毕30 min后，人员即可进入，不影响正常生产。

根据《消毒技术规范》和实践应用数据，在GMP制药车间的洁净区，洁净级别十万级消毒需要保持臭氧浓度为10 mg/m3，万级为30 mg/m3。在消毒过程中湿度要控制在70% ～80%，低于45%时消毒效果就会受到很大影响。

1.2.2 对物品的消毒

进入万级洁净区的物品，除用热力灭菌之外，其余物品如血清瓶、消毒液等，均需用0.2%新洁尔灭或5%甲酚皂擦拭容器外壁消毒。病毒区使用过的细胞瓶在装入灭菌柜之前要用4%NaOH 500 mL涮洗内壁，冻破的病毒液瓶应浸泡在4%NaOH中24 h以上。各种设备、金属仪器如干燥箱、高压柜、显微镜等应定期用消毒液擦拭，一般每3天1次。在细胞的传代过程中，操作人员的手每接触一次细胞瓶口，都要用酒精棉球擦拭手及瓶口。

2 影响消毒效果的因素

各种消毒灭菌方法都有其影响因素，在使用过程中如不注意这些影响因素，就可能会对消毒效果产生直接影响。各种消毒灭菌方法的影响因素简述如下:

2.1 影响热力消毒和灭菌的因素

(1)微生物的种类和生存环境:不同种类的微生物或是同种但非同种株的微生物的热耐受力是不一样的。微生物的生存环境对其耐热能力有很大影响。当微生物生存在富含血清、蛋白质、碳水化合物等物质在内的环境时，对热的抵抗力将会增强。

(2)加热时的环境:加热时，微生物外环境中的气压、酸碱度、离子的浓度等都可影响消毒效果。

(3)被消毒物的种类和大小:不同种类的被消毒物品，其传热能力不同。金属制品消毒时，一般15 min即可，而传热能力差的衣物等则要30 min。

2.2 影响过滤除菌的因素

影响过滤除菌效果的因素主要有过滤材料的结构、特性、滤床的层次以及滤孔大小、纤维带电的强弱等。一般滤器的孔径小于0.5～5.0μm即可达到良好的除菌目的。滤床层次多、滤料纤维带电强时，过滤除菌效果会增强。

2.3 影响紫外线消毒作用的因素

2.3.1 微生物自身的因素

(1)微生物的类型:不同微生物对紫外线照射的敏感性不同，对紫外线最为敏感的是革兰氏阴性菌，其次为革兰氏阳性菌，再次为芽孢。病毒也能被紫外线灭活。

(2)微生物的数量:微生物的数量越多，需要产生相同致死作用的紫外线照射剂量也就越大。

(3)生长期或芽生期的差别。

(4)悬浮的类型:枯草杆菌芽孢在灰尘中悬浮比在气溶胶中悬浮时，对紫外线照射有更大的抗性。

2.3.2 有机物的影响

胨、蛋、牛奶，特别是血和血清的存在对紫外线的消毒效果有一定影响，当有机物存在时，需延长消毒时间。

2.3.3 环境因素

(1)温度的影响:大多数的微生物(除了耐辐射微球菌属外)在低温时对紫外线辐射很敏感。另外，环境温度对紫外线灯的输出强度也有影响，一般以室温条件(27～40℃)输出强度最大，环境温度过高或过低都使输出强度降低。

(2)湿度的影响:紫外线照射消毒时要求相对湿度在60%以下。

2.3.4 紫外线辐射波长的影响不同波长紫外线的杀菌力不同，如表2。

表2 不同波长紫外线杀菌力比较

2.4 影响化学消毒效果的因素

2.4.1 消毒剂方面的因素

(1)药物的特异性:某些药物只对某一部分微生物有抑制作用，而对另一些微生物则效力很差。

(2)药物的浓度:消毒剂的消毒效果一般与其浓度成正比。

(3)消毒剂的物理状态:只有溶液才能进入微生物体内，起到应有的消毒效果。所以固体消毒剂必须溶于水中，气体消毒剂必须溶于细菌周围液层中，才有杀菌作用。

2.4.2 环境方面的因素

(1)温度:一般消毒剂，当温度升高时，杀菌能力加强。

(2)湿度:每种气体消毒剂都有其适宜的相对湿度。

(3)pH:酸碱度对细菌和消毒剂均有影响。pH改变时，细菌的电荷也发生改变。同时，pH值也影响消毒剂的电离度。

(4)有机物的存在:覆盖于菌体表面的有机物，具有机械性保护作用。

(5)接触时间:微生物与消毒剂接触的时间愈久，死亡数目愈多，消毒效果越好。

2.4.3 微生物方面的因素

(1)微生物种类及其特性:不同种类的微生物对各类消毒剂的敏感性是不完全一样的;细菌的繁殖体及其芽孢对化学药物的抵抗力不同;生长期和静止期的细菌对消毒剂的敏感程度亦有差别。

(2)微生物的数量:微生物的数量越多，所需消毒剂剂量就越大，需要作用的时间也越长。

3 结论

在疫苗生产过程中消毒与灭菌的方法是否得当，效果是否可靠，是疫苗生产能否顺利进行的重要影响因素。因此不断的总结、研究疫苗生产过程的消毒方法、消毒剂类型对疫苗生产顺利进行、疫苗质量的提升将起到极大的促进作用。