抑肝散抗小鼠脑缺血/再灌注损伤的作用研究(Ⅰ)

王 敏，傅 强，马占强，马世平

中国药科大学中药药理教研室，南京 211198

缺血性脑血管病是一种常见病和多发病，是目前严重危害人类健康与生命的主要疾病之一，因具高发病率、高死亡率、高致残率和高复发率等特点而引起国内外医学界的广泛关注与高度重视[1]。抑肝散出自于《保缨撮要》，由当归、钩藤、茯苓、白术、川芎、柴胡及甘草等组成，主治神经症、不眠症、小儿夜啼等。近年来，中日两国学者应用该方治疗血管性痴呆、急性缺血性脑病和中风后遗症，疗效显著[2-4]。本文用小鼠缺血再灌注模型模拟人类脑梗死，观察抑肝散对脑缺血的保护作用。

1 材料与方法

1.1药品和试剂

抑肝散方中各药材均购于南京市金陵大药房并经本校秦民坚教授鉴定：当归为Angelica sinensis(Oliv.)Diels的根，钩藤为Unearia rhynchophy lia(Miq.)Jacks的干燥带钩茎枝，川芎为Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，白术为Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎，茯苓为Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，柴胡为 Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根，甘草为Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根茎。实验时按原方比例称取药材，常规水煎煮，浓缩，用时加蒸馏水配成所需浓度。实验中所用剂量均按生药量计算。

尼莫地平(Nimodipine，Nim)，天津市中央药业有限公司产品，批号:090502；无水乙醇，南京化学试剂厂产品，批号:080110046；水合氯醛，中国医药(集团)上海化学试剂公司，批号:20080610；2,3,5-三苯基氯化四氮唑，批号:20100423，Amresco。除尼莫地平之外，以上均为分析纯。一氧化氮、一氧化氮合酶（NOS）试剂盒（批号:20100303、20100323）；考马斯亮兰测定试剂盒（批号:20091214），以上购于南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器

HH-4数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)；纯水机(Hi-tech Instruments Co.Ltd)；电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)；台式高速冷冻离心机(Sigma，美国)；DG3022A型酶级联反应检测仪(Thermo Electron 公司，美国)；恒温干燥箱（Ecocell，德国）；Kubota 5800离心机（久保田公司，日本）。

1.3 动物

SPF级ICR雄性小鼠，江苏省南京市青龙山动物养殖场提供，许可证号SCXK(苏)2007.0001，体重18～22 g，动物分笼饲养，保持12 h昼夜节律，室温(22±1)℃，自由饮水摄食。

1.4 分组、给药及造模

分组及给药：小鼠随机分为6组，每组8只。假手术组(正常组)；模型组；尼莫地平组(0.6 mg·kg-1)；抑肝散低(3 g·kg-1)、中(6 g·kg-1)、高(12 g·kg-1)剂量组。给药7 d末次给药1 h后手术，模型组及假手术组灌胃相同容积水。

局灶性脑缺血/再灌注模型的制备[5]：将小鼠用4%水合氯醛(350 mg·kg-1)麻醉后，仰卧固定在手术台上，常规消毒，颈正中切口，分离暴露右侧颈部血管，将颈外动脉(ECA)、颈总动脉(CCA)结扎，颈内动脉(ICA)轻微系扎。在颈总动脉上做一切口，将制作好的鱼线插入颈内动脉，继续进线直到略感阻力为止。此时，鱼线前端已经阻断大脑中动脉(MCA)起始段及其所有血液供应，造成 MCA局灶性缺血，缝合皮肤。经过1 h的梗塞后，轻轻地将鱼线拉出 MCA起始段，进行再灌注，放回笼中保温饲养,1 h后进行神经功能评分。假手术组的麻醉及手术过程与模型组相同，但不阻断颈总动脉，观察时间与模型组相同。在全部造模过程中保持动物肛温在37℃左右。

1.5 神经功能缺陷评分

整个评分采用单盲法，即评分者不知道实验动物分组情况。采用Longa[6]的5分评分标准：0分为无症状；1分为不能完全伸展对侧前爪；2分为向对侧转圈；3分为向对侧倾倒；4分为不能自行行走，意识丧失。剔除0分、4分和术后死亡动物，满足1、2、3分的动物均为造模成功。

1.6 脑含水量、脑指数及脑梗死率的测定[7]

小鼠脑缺血再灌注24 h后断头取脑，去小脑及延脑。称重(湿脑重)，计算脑指数(脑指数=湿脑重×100/体重)。然后在110℃烤箱中烤至恒重，分析天平称重(干脑重)，计算脑含水量，脑含水量（%）=(湿脑重-干脑重)/湿脑重×100%。

另一部分小鼠脑去除嗅脑、小脑和低位脑干，取左侧大脑半球沿冠状面切成5片，进行TTC染色，置37℃温育10 min后，正常组织呈红色，梗死组织呈白色。小心挖取并称重白色组织，以梗塞组织重量占全脑重量百分比为脑梗死率。

1.7 组织病理检查

小鼠脑缺血再灌注24 h后断头取脑，去小脑及延脑。在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干。甲醛固定，冠状面切为三部分，常规包埋，各组取相同部位制成连续切片。切片厚5 μm，HE染色，光学显微镜观察。

1.8 脑组织中NO、总NOS、iNOS含量的测定

小鼠断头取脑，去除嗅脑、脑干、小脑后将大脑分别置于匀浆器中，用冰生理盐水按质量与体积为1∶9的比例，冰浴下制备成体积分数为10%的脑组织匀浆,2500 r·min-1，离心 15 min，取上清液备用。按照试剂盒说明书测定脑组织中NO、总NOS、iNOS含量。蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定。

1.9 统计学处理

2 实验结果

2.1 抑肝散对脑缺血/再灌注小鼠神经功能缺陷评分的影响

脑缺血再灌注1 h后,除正常组之外所有实验动物均出现了不同程度的神经运动功能障碍，抑肝散各剂量组动物的神经功能缺陷评分均呈下降趋势，肌力明显增加，中、高剂量组与模型组比较，差异有统计学意义，结果见表 1。

2.2 抑肝散对脑缺血再灌注小鼠脑梗死率的影响

小鼠缺血再灌注后经TTC染色后，假手术组脑片全红；模型组小鼠缺血侧额、顶叶皮质及纹状体可见明显的白色梗死灶，其梗死率为21.45%；抑肝散低、中、高各剂量组小鼠脑梗死率明显降低，与模型组比较差异有统计学意义。结果见表1。

表1 抑肝散对脑缺血/再灌注小鼠在神经功能缺陷评分和梗死率的影响(±s，n=8)

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 模型组

2.3 抑肝散对脑缺血/再灌注小鼠脑组织病理改变的影响

HE染色后可见模型组大脑皮层灰质细胞层次紊乱，大部分神经细胞受压，体积缩小，细胞质和细胞核固缩，核染色深(神经细胞萎缩)，细胞及毛细血管间隙明显增宽，小动脉扩张充血，间质明显水肿，呈网格状，与正常组有明显的形态差异；而抑肝散中、高剂量组和阳性药组可以明显改善由脑缺血引起的病理学改变。结果见图1。

图1 抑肝散对小鼠脑缺血/再灌注的脑细胞病理学改变

2.4 抑肝散对脑缺血/再灌注小鼠脑含水量和脑指数的影响

实验表明，模型组脑含水量及脑指数与假手术对照组比较均明显增加。而抑肝散中、高剂量组和尼莫地平组能明显降低脑含水量，抑肝散中、高剂量组及尼莫地平组脑指数较模型组明显降低。见表2。

表2 抑肝散对脑缺血/再灌注小鼠脑含水量和脑指数的影响(±s，n=8)

表2 抑肝散对脑缺血/再灌注小鼠脑含水量和脑指数的影响(±s，n=8)

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs模型组

组别

2.5 抑肝散对脑缺血/再灌注小鼠脑内NO、总NOS、iNOS含量的影响

NO、总NOS、iNOS含量测试结果显示，与正常组相比，模型组的含量有明显的升高，除抑肝散低剂量组外各给药组均能明显降低模型小鼠脑组织中NO、总NOS、iNOS的含量。 见表3。

表3 抑肝散对脑缺血/再灌注小鼠NO、总NOS、iNOS含量的影响(±s，n=8)

表3 抑肝散对脑缺血/再灌注小鼠NO、总NOS、iNOS含量的影响(±s，n=8)

注：*P＜0.05，**P＜0.01 vs 模型组

3 讨 论

缺血性脑血管疾病的发病率、致残率和病死率均较高，一般以局灶性脑缺血为主，其中大脑中动脉栓塞造成的脑梗死最为多见。本实验以此为依据，研究抑肝散对小鼠大脑中动脉缺血再灌注模型的影响。结果显示，抑肝散给药组小鼠的神经行为学缺陷明显改善，脑梗死率和脑含水量明显降低。脑组织病理学检查表明，抑肝散可显著改善因缺血再灌注引起的神经细胞萎缩、细胞及毛细血管间隙的增宽和小动脉的扩张充血，表明抑肝散对小鼠脑缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。

缺血再灌注损伤发病机制中，NO具有非常复杂的双重作用,在脑缺血早期，NO的产生具有神经保护作用，松弛血管平滑肌，抑制血小板和白细胞的聚集与粘附，调节脑血流量，参与学习记忆过程[8]。随着缺血时间的延长，尤其是进入再灌注期，由于能量代谢衰竭，可致离子泵功能障碍，兴奋性氨基酸释放大量钙离子内流，产生大量的NO，过量的NO可通过激活鸟苷酸环化酶而使cGMP水平升高、扩张脑血管、增加脑水肿，高浓度NO可抑制各种线粒体电荷传递系统的酶，抑制细胞呼吸和能量代谢，并且通过氧化应激反应生成大量活性氧物质和过氧亚硝酸盐，引起内皮细胞损伤坏死，脂质过氧化，导致高蛋白水肿液的渗出和表面活性物质的失活，从而造成不可逆神经元细胞的损伤。NOS是NO合成过程中重要的限速因素，体内NO的生物作用完全依赖NOS的活性。因此，测定NOS是研究NO生理病理作用的重要环节，目前已经确定的NOS亚型主要有神经元型NOS(nNOS)、内皮型NOS(eNOS)和诱生型NOS(iNOS)[9-10]。本实验发现在脑缺血1 h再灌注24 h后脑组织NO、总NOS、iNOS含量显著升高，抑肝散能明显降低这3种物质的含量，从而减轻NO的神经细胞毒性，有效减轻缺血再灌注损伤。

本实验结果提示，抑肝散可能通过降低NO的神经毒性而对缺血再灌注脑损伤发挥保护作用,但缺血再灌注脑损伤的发生机制复杂,各种因素间可能相互促进、相互影响。 抑肝散究竟是通过直接还是间接途径降低NO的神经毒性,值得进一步探讨。

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