肝癌患者血清血管内皮生长因子和内皮抑素水平的变化及意义

杨焕东，杨桂莲，张春元，张春梅，王慎田

血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)和内皮抑素 (endostatin)分别是目前已知的作用最强的血管生成促进因子和抑制因子，深入研究两者在肿瘤生长、浸润、转移中的作用及手术前后的变化规律，对肿瘤早期诊断和判断预后具有重要的临床意义。关于原发性肝癌二者联合检测的意义未见报道。本研究采用ELISA法测定原发性肝癌患者血清VEGF和内皮抑素水平，并以慢性乙型肝炎肝硬化和健康人群作为对照，探讨血清VEGF和内皮抑素水平的变化及其与临床病理特征的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2005年3月—2009年3月在潍坊医学院附属益都中心医院消化科和普外科收治的原发性肝癌患者163例 (肝癌组)，多属于中、晚期，其中男112例，女51例;年龄28～69，平均 (53.2±10.5)岁。根据临床症状和体征、B超、CT、肿瘤标志物确诊，部分病例术后经病理切片进一步诊断。另选取同期慢性乙型肝炎肝硬化患者75例 (肝硬化组)，其中男59例，女16例;年龄33～67岁，平均 (54.8±9.6)岁。同期健康志愿者及健康查体检者60例 (正常对照组)，其中男42例，女18例;年龄24～71岁，平均 (52.3±11.2)岁。试验前对所有受试者履行知情同意告知并获同意后入选本试验。

1.2 方法 所有患者于入院后未治疗前清晨空腹 (健康人群则随机清晨空腹)抽取外周静脉血4 ml，室温放置30～60 min后3 000 r/min离心10 min，分离并留取血清置-70℃低温冷冻备用。部分手术和 (或)介入治疗的患者于术后2周同法收集血清冷冻备用。用ELISA法测定血清VEGF及内皮抑素水平，检测方法严格按试剂盒说明书进行。全自动酶标仪测定光密度值 (D值)，VEGF检测波长为450 nm，内皮抑素检测波长为490 nm。绘制标准曲线，通过标本的D值在标准曲线上查出其对应浓度。人VEGF ELISA试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司，人内皮抑素ELISA试剂盒购自美国R＆D公司。

1.3 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。计量资料以表示，各组间均数比较用t检验或方差分析。p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组受检者血清VEGF和内皮抑素水平比较 肝癌组患者术前血清VEGF和内皮抑素水平均显著高于肝硬化组和正常对照组，差异有统计学意义 (p＜0.01);而肝硬化组与正常对照组血清VEGF和内皮抑素水平比较，差异均无统计学意义(P ＞0.05，见表1)。

2.2 原发性肝癌患者血清VEGF、内皮抑素水平与临床特点及分期之间的关系 不同性别、是否合并肝硬化的原发性肝癌患者血清VEGF和内皮抑素水平比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。肿瘤直径＜5 cm者血清VEGF、内皮抑素水平显著低于肿瘤直径＞5 cm者，有门静脉癌栓的原发性肝癌患者血清VEGF和内皮抑素水平显著高于无静脉癌栓的患者，差异均有统计学意义 (p＜0.01)。TNMⅠ、Ⅱ期的原发性肝癌患者血清VEGF和内皮抑素水平比较，差异无统计学意义 (P＞0.05);但当肿瘤发展到Ⅲ、Ⅳ期时，血清VEGF和内皮抑素水平显著升高，与Ⅰ、Ⅱ期比较差异均有统计学意义 (p＜0.01，见表2)。

表1 肝癌组、肝硬化组、正常对照组血清VEGF和内皮抑素水平比较(，ng/L)Table 1 The comparison of serum VEGF and endostatin level in hepatocellular carcinoma group，posthepatitic cirrhosis group and control group

表1 肝癌组、肝硬化组、正常对照组血清VEGF和内皮抑素水平比较(，ng/L)Table 1 The comparison of serum VEGF and endostatin level in hepatocellular carcinoma group，posthepatitic cirrhosis group and control group

注:与肝硬化组及正常对照组比较，*p＜0.01

组别 例数 VEGF 内皮抑素肝癌组 163 412.3 ±145.6* 45.6 ±11.7*肝硬化组 75 168.5 ± 72.4 33.2 ± 9.6正常对照组 60 164.6 ± 68.5 31.4 ±10.4 F 值＜0.01 ＜0.01 11.7 8.4 P值

表2 原发性肝癌患者血清VEGF和内皮抑素水平与临床特点及分期之间的关系Table 2 Relationship between serum VEGF and endostatin levels and clinicopathologic features in hepatocellular carcinoma

2.3 原发性肝癌患者术前术后血清VEGF和内皮抑素水平的变化 107例肝癌患者行外科和 (或)介入手术治疗，术前血清VEGF水平为 (388.4±124.2)ng/L，术后 2周下降为(213.5±98.3)ng/L;术前血清内皮抑素水平为 (42.5±10.4)ng/L，术后 2 周明显升高，为 (53.8 ±11.9)ng/L。术前、术后VEGF、内皮抑素水平比较，差异均有统计学意义(t值分别为11.45 和7.40，P ＜0.01)。

2.4 血清VEGF水平和内皮抑素水平之间的相关性 肝癌组患者术前内皮抑素水平与VEGF水平呈正相关 (r=0.658，p＜0.01)，而肝硬化组和正常对照组受检者内皮抑素水平与VEGF水平无相关性 (r值分别为0.178和0.087，P＞0.05)。

3 讨论

肿瘤血管新生是肿瘤生长和转移的基础，是肿瘤发生发展的关键环节之一。新生血管不仅为肿瘤生长提供营养物质和氧以及排出代谢废物，并为肿瘤细胞进入血液循环和转移提供可能，因此血管生成在肿瘤形成以及以后的发展、转移中发挥着极为重要的作用，是肿瘤得以迅速生长和发展的关键［1］。肿瘤血管生成是一个多基因、多因子参与的过程，在这一过程中肿瘤细胞不仅能分泌许多种促进血管形成、加速肿瘤发展的因子，同时也能分泌许多抑制血管形成、促使肿瘤消退、凋亡、防止转移的因子［2-3］。该过程受到“血管生成开关”系统精密调控，使血管生成刺激因子和抑制因子保持平衡［4］。肿瘤生长还是消减取决于促进血管生长因子和抑制血管生长因子含量的变化［5］。VEGF是目前已知的作用最强、特异性最高的血管生成调控因子［6］，它不仅能与位于血管、淋巴管内皮细胞表面的受体结合，通过调节血管和淋巴管的生成、增加其通透性而促进肿瘤生长和转移，还能通过自分泌途径与肿瘤细胞表面的受体相结合，直接促进肿瘤生长［7］。近年发现的内皮抑素则被认为是迄今为止最有效的内源性血管生长抑制因子之一［8］。体外和动物实验表明内皮抑素及其类似物在体外能有效抑制内皮细胞的生长、移行，在体内显著退缩和停滞原发瘤和转移瘤的生长［8］。内皮抑素可竞争性阻断VEGF诱导血管生成的信号传导通路，减少血管内皮细胞膜VEGF受体的数量，降低体内VEGF mRNA水平表达［9］。内皮抑素和VEGF的作用相互拮抗，共同影响肿瘤新生血管的生成。有关联合检测肝癌患者血清VEGF和内皮抑素水平及其手术前后动态变化的研究未见报道。

本研究发现原发性肝癌患者术前血清VEGF和内皮抑素水平均显著高于良性病变慢性乙型肝炎患者和健康者，与Kuroi等［10］的研究结果一致，表明肝癌细胞确能分泌大量的VEGF，促进肿瘤血管生成，以提供肿瘤细胞生长所需的营养物质并为肿瘤转移提供条件。同时，肿瘤组织通过多种途径刺激机体产生大量内皮抑素，经血液循环到达肿瘤部位，抑制原发和继发肿瘤血管的生成，与血管生成促进因子的作用相拮抗，达到一种平衡。

本研究观察到，肝癌患者术前血清VEGF和内皮抑素水平与原发肿瘤大小、有无门静脉癌栓以及临床病理分期密切相关，而且术前血清VEGF和内皮抑素水平呈明显正相关。随着肿瘤增大，血清VEGF、内皮抑素水平明显升高。随着肿瘤分期的不断进展，血清VEGF、内皮抑素水平亦不断升高，Ⅲ期和Ⅳ期肝癌患者的血清VEGF、内皮抑素水平显著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者。说明随着恶性程度的升高，肿瘤分泌VEGF、内皮抑素均增加，但两者增加的程度可能并不平行，加之肿瘤组织还可产生其他血管生成促进因子和抑制因子，使得“血管生成开关”处于开放状态，促血管生成效应占据优势，恶性肿瘤得以无限制地生长、侵袭和远处转移。有研究表明快速生长的癌组织极易出现缺血缺氧，导致VEGF大量分泌，以加速血管内皮细胞的增殖和分化，促使新生血管生成，从而满足肿瘤生长的需求。肿瘤的恶性程度越高，对氧的需求越高，VEGF的分泌也越多。同时，随肿瘤恶性程度增高，蛋白水解酶分泌增加，降解血管基底膜中的胶原蛋白，使内皮抑素的生成也相应增加［11-12］。本研究认为，术前血清VEGF、内皮抑素水平可反映肿瘤部位的血管增生程度及体内肿瘤负荷的大小，作为评价肝癌恶性程度及进展程度的指标，并有可能作为抗血管治疗的效应指标。

本研究结果显示，肝癌患者行手术治疗后血清VEGF水平较术前均有明显降低，而内皮抑素水平则较术前升高。提示作为有效的治疗手段，根治性手术的“去肿瘤负荷作用”解除了肿瘤对机体的浸润及血管生成的影响，使得肿瘤新生血管生成减少，在一定程度上减缓了肿瘤的进展，可作为判断手术疗效及预后的指标。

1 李胜棉，张慧景，吴义娟，等.HBV相关及HCV相关肝细胞肝癌组织中8-羟基脱氧鸟苷酸和CD34及Ki-67的表达研究 ［J］.中国全科医学，2011，14(5):1669.

2 Gupta MK，Qin RY.Mechanism and its regulation of tumor-induced angiogenesis［J］.World J Gastroenterol，2003，9(6):1144-1155.

3 徐英，颜浩.恶性肿瘤雌激素受体及其拮抗剂与血管内皮生长因子关系的研究进展［J］.实用心脑肺血管病杂志，2010，18(5):683.

4 Folkman J.Role of angiogenesis in tumor growth and metastasis ［J］.Semin Oncol，2002，29(6 Suppl 16):15-18.

5 Aragon-Ching JB，Dahut WL.The role of angiogenesis inhibitors in prostate cancer［J］.Cancer J，2008，14(1):20-25.

6 Kösem M，Tuncer I，Kotan C，et al.Significance of VEGF and microvascular density in gastric carcinoma ［J］.Hepatogastroenterology，2009，56(93):1236-1240.

7 陶晓峰，刘畅.缺氧诱导因子1α和血管内皮生长因子与肝细胞癌分化及其侵袭性的相关性研究［J］.中国全科医学，2011，14(1):164.

8 Faye C，Chautard E，Olsen BR，et al.The first draft of the endostatin interaction network ［J］.J Biol Chem，2009，284(33):22041-22047.

9 Kim YM，Hwang S，Kim YM，et al.Endostatin blocks vascular endothelial growth factor-mediated signaling via direct interaction with KDR/Flk-1 ［J］.J Biol Chem，2002，277(31):27872-27879.

10 Kuroi K，Tanaka C，Toi M.Circulating levels of endostatin in cancer patients［J］.Oncol Rep，2001，8(2):405-409.

11 Feldman AL，Alexander HR Jr，Bartlett DL，et al.A prospective analysis of plasma endostatin levels in colorectal cancer patients with liver metastases ［J］.Ann Surg Oncol，2001，8(9):741-745.

12 Fernando NT，Koch M，Rothrock C，et al.Tumor escape from endo-genous，extracellular matrix-associated angiogenesis inhibitors by upregulation of multiple proangiogenic factors［J］.Clin Cancer Res，2008，14(5):1529-1539.