不同运动方式对大鼠骨骼肌线粒体融合分裂基因及Mfn2、Drp1蛋白表达的影响

漆正堂 郭维 张媛 贺杰 丁树哲

1 华东师范大学体育与健康学院（上海 200241） 2 杭州体育科学研究所

细胞生命过程中，线粒体管网进行着不间断地分裂和融合，二者维持动态平衡对细胞积极而灵敏地适应环境具有重要意义［1］。执行线粒体融合与分裂的基因和蛋白已被发现，Mfn1/2和OPA1是线粒体融合所必需的，融合基因缺陷可导致线粒体片段化；hFis1和Drp1是线粒体分裂所必需的，分裂基因缺陷可导致线粒体管网化［2］。研究还发现，Mfn1/2、OPA1和Drp1是GTP结合蛋白，具有GTPase活性；hFis1无GTPase活性。Mfn1/2、OPA1和Drp1水解GTP，使自身蛋白质构象发生改变，对线粒体融合分裂是必需的。Mfn1/2、OPA1、Drp1、hFis1都是线粒体结构发生动力学变化的直接执行者［3］。

此前，已有少数研究关注过运动对线粒体融合基因表达的影响，观测点主要有两种。一是观测线粒体融合基因相对于急性运动的时相性表达。Cartoni等研究表明，Mfn1、Mfn2的mRNA表达水平在运动后24小时显著上调，Mfn2基因表达可能受PGC-1α/ERRα驱动［4］。孙卫东等报道Mfn1/2 mRNA表达在一次递增负荷急性运动中和运动后恢复期呈现类似超量恢复的时相性变化［5］。急性运动中骨骼肌Mfn1/2 mRNA表达逐渐减少，恢复期骨骼肌Mfn1/2 mRNA表达水平逐渐增加直至超过运动前的安静水平，说明线粒体融合基因的动态表达是线粒体对细胞能量需求急增的一种快速应答反应。二是观测线粒体融合基因相对于长期运动的适应性表达。健康人经过一定时期体育锻炼后，Mfn2基因的转录水平与肌肉的氧化磷酸化活性和PGC-1α mRNA密切正相关［6］。运动和减体重上调Mfn2表达，肥胖、糖尿病、TNFα/IL-6暴露则下调Mfn2表达［7］。也有研究发现，长期运动可上调健康人Mfn1/2基因表达，但对糖尿病人无此功效［8］，表明线粒体融合基因对运动的应答与机体病理状态也有关。机体运动的主要特征包含骨骼肌收缩力量和（或）收缩频率的增加，线粒体的运动适应具有运动方式的特异性［9］。大部分研究支持长时间低强度有氧运动是诱导线粒体生物发生的主要运动方式，力量练习是诱导骨骼肌蛋白合成增加、体积质量增长的主要运动方式。大强度间歇性运动在肌肉收缩力量与收缩频率上与以上运动方式都有显著差异。本研究假设骨骼肌线粒体融合分裂基因与蛋白表达可能受到不同运动方式的影响。本研究通过比较长时间低强度耐力运动和大强度间歇性运动对骨骼肌线粒体融合分裂基因与蛋白表达的影响，探讨不同运动方式下线粒体管网结构发生运动适应的动力学差异，进一步揭示线粒体运动适应的特异性以及运动防控线粒体疾病的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级Sprague-Dawley雄性大鼠30只，约5周龄，体重133.4±9.5 g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2007-0005。实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2004-0001。国家标准啮齿类动物常规饲料及垫料由上海斯莱克实验动物有限公司提供，自由饮食，饲料供给量根据体重增长相应增加，每周更换垫料2～3次，环境温度20～23℃，相对湿度50～70%，自然光照。

1.2 主要试剂与仪器

RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen；cDNA第一链合成试剂盒购自Promega；SYBR green PCR MasterMix购自TOYOBO。Western Blot常规试剂购自上海生工，一抗、二抗购自Santa Cruz，PVDF膜购自Milipoler。酶标仪：Tecan Infinite M200型；Real-time PCR仪：Applied Biosystem StepOne型；离心机：Eppendorf 5804/R型；电泳仪、垂直电泳槽、半干转膜仪：BIO-RAD；凝胶成像仪：TANON GIS-2008。

1.3 动物分组及运动方案

30只大鼠在实验室适应性喂养1周，然后随机分为3组，即安静对照组（Con），耐力运动组（ET），间歇性运动组（SIT），每组10只。ET组运动强度不高于16.7 m/min（< 60%VO2max），第1周运动时间30 min/天，第2～4周40 min/天，第5～8周60 min/天，坡度均为0。SIT组执行大强度间歇性运动方案，运动强度不低于42 m/min（>100%VO2max），每日进行9～10次10 s冲刺跑，次间间歇30～60 s，每完成3次间歇3 min；第1～2周坡度为0，第3～4周为5%，第5～8周为10%。ET和SIT组进行跑台训练8周，训练时段为晚间18:30～22:00，周日停训一次。

1.4 取材

最后一次训练结束后休息24 h，大鼠断颈处死。在20 min内分别取完整的左右下肢腓肠肌，切分若干份后置于液氮中速冻，－70℃超低温冰箱保存，待检测。

1.5 Real-time PCR

取腓肠肌样品100 mg左右，RNA抽提参照Trizol试剂盒说明书进行。取9.5 µl总RNA（约含RNA 0.5 pg～1 µg），以oligo dT为引物进行反转录，进行cDNA合成。

PCR按以下反应体系进行：2×SYBR green PCR MasterMix（SYBR green I、HotStart Taq DNA Polymerase、Reaction Buffer、dNTP、Mg2+）10 µl，上下游引物各 1µl，ddH2O 4 µl，模板 cDNA 4 µl，总体积20 µl。反应条件：预变性（95℃，1 min）；40个PCR循环（95℃，15 s；61℃，30 s；72℃，45 s，收集荧光）。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，再变性（95℃，75 s），退火（55℃，60 s），然后从55℃缓慢加热到95℃，15 s；每1℃收集荧光。熔解曲线只显示一个主波峰，说明PCR扩增的特异性较高，符合荧光定量PCR的技术要求。反应结束后，PCR仪给出各反应孔的Ct值，以β-actin基因为内参，根据公式2-ΔΔCt计算各样品目的基因的相对表达量。扩增引物见表1，引物序列查自NCBI数据库，由上海生工生物技术有限公司合成。

表1 实时荧光定量PCR的引物序列

1.6 Western Blot

取100 mg腓肠肌组织放入小烧杯中，加入1 ml提前预冷的匀浆介质（甘露醇210 mM，蔗糖70 mM，Tris-HCl 5 mM，EDTA 1 mM，PMSF 0.1 mM，DTT 0.5 mM）；剪碎肌组织，尽量去除结缔组织、脂肪等；电动匀浆，匀浆液倒入离心管①，1300g 4℃离心10 min；吸上清到离心管②，将上清17,000g 4℃离心15 min；抽吸弃去上清，同时保留沉淀（线粒体），加入1 ml匀浆介质，重悬；重悬液17,000g 4℃离心15 min；抽吸弃去上清，保留沉淀（线粒体），加入0.5 ml匀浆介质，重悬，即线粒体蛋白样品。采用BCA法测定蛋白含量。

将样品稀释至相同蛋白含量，取100 µl样品加入 5×SDS上样 buffer，95℃处理 10 min。每孔加样30 µl。接通电源，以电压120 V、电流60 mA电泳。电泳后将蛋白转至PVDF膜。将膜在一抗中孵育，4℃过夜（一抗溶于封闭液，1:200稀释）；用TTBS洗三次，每次轻摇10 min；在二抗（1:2000用封闭液稀释）中孵育1 h；用TTBS洗三次，每次轻摇10 min。用DAB 显色，用TANON GIS-2008凝胶成像仪拍照并用天能GIS 凝胶图像处理系统进行数据分析，靶蛋白与内参蛋白条带（VDAC1，线粒体外膜蛋白）的密度之比作为靶蛋白的相对表达水平。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠骨骼肌Mfn1/2、OPA1、Drp1、hFis1 mRNA表达

如图1所示：ET组Mfn1 mRNA表达显著高于Con组（P < 0.05），但SIT组与ET组之间无显著差异。SIT组Mfn2 mRNA表达显著低于Con组 （ P < 0.05），但SIT组与ET组之间无显著差异。SIT组OPA1 mRNA表达显著高于ET组（P < 0.05）。SIT组Drp1 mRNA表达显著高于Con组（P < 0.05）和ET组（P < 0.01）。与Con比较，ET组和SIT组hFis1 mRNA表达均无显著变化。

2.2 各组大鼠骨骼肌线粒体Mfn2、Drp1蛋白水平

如图2所示：SIT组线粒体Mfn2蛋白表达显著高于Con组（P < 0.05），但SIT组与ET组之间无显著差异。SIT组线粒体Drp1蛋白表达显著低于Con组和ET组（P < 0.05）。

3 讨论

线粒体的总体形态（管网状或片段化）依赖于融合、分裂蛋白的相对活性。线粒体空间形态的动力学变化与线粒体代谢、氧化磷酸化、肌肉生物发生以及线粒体疾病的发生都密切相关。Mfn1/2异常表达与Charcot-Marie-Tooth 2A型神经病（CMT2A）、肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗等代谢性疾病的发病机制有关，对神经、骨骼肌病变有重要病理意义。抑制Mfn2基因导致线粒体管网脆裂，功能受损，葡萄糖氧化、线粒体膜电位、细胞呼吸和线粒体质子漏均下降；三羧酸循环、电子传递链被抑制，细胞能量代谢转为糖酵解，糖原合成率下降［10，11］。而Mfn2过度表达则引起呼吸链复合物、线粒体氧化和细胞糖原利用增加［12］。哺乳动物肌肉发生时Mfn2基因被显著诱导，帮助维持和更新线粒体管网。阻断小鼠Mfn1和Mfn2基因表达将导致骨骼肌严重缺失，小鼠存活年龄仅2个月左右，肌肉质量、横截面积以及肌纤维宽度均骤减［13］。Zucker肥胖鼠、肥胖人和糖尿病病人中Mfn2蛋白和mRNA表达均降低，提示线粒体融合分裂调节异常参与了胰岛素抵抗的发生［7］。正常的线粒体融合对于mtDNA稳定性、线粒体的细胞定位与物质转运都是必须的［14-16］；Mfn1/2对不同生理刺激能产生基因转录或蛋白表达水平的应答。因此，研究不同运动方式对骨骼肌Mfn1/2、OPA1表达的影响可为运动干预、治疗相关疾病提供分子依据和锻炼策略。

本研究旨在观察骨骼肌线粒体融合基因相对于长期运动的适应性表达，重在比较长时间低强度的耐力运动与大强度、间歇性运动效果的差异。本实验发现，尽管耐力运动上调Mfn1 mRNA表达（P < 0.05），但Mfn2的mRNA以及线粒体Mfn2的蛋白表达对耐力运动均表现沉默。许多研究提示，Mfn1功能相对单一，主要参与线粒体融合的执行过程；尽管Mfn1、Mfn2对于线粒体融合都是必不可少的，但Mfn2在更多情况下都参与了线粒体代谢调节与线粒体疾病的发生，甚至可以认为Mfn2是一个比较重要的代谢调节因子［11，12，17］。从Mfn1、Mfn2、OPA1基因表达的总体来看，我们推测：长时间低强度耐力运动对健康大鼠骨骼肌线粒体代谢的扰动也许并不显著。低强度耐力运动对机体的作用可能更多表现在对健康稳态的维持，这在健康机体的运动适应方面与大强度、间歇性运动有明显区别。相对而言，大强度间歇性运动对Mfn2、OPA1的影响较剧烈，大强度间歇性运动使线粒体Mfn2蛋白上调（P < 0.05），但Mfn2 mRNA下调（P< 0.05），大强度间歇性运动使OPA1mRNA表达显著高于耐力运动组（P < 0.05），但对Mfn1 mRNA却无明显影响。这提示：在等长训练周期中，线粒体融合基因与蛋白对两种运动方式有差异性适应机制，这种差异来源于运动方案的差异。我们推测Mfn1 mRNA表达对长时间低强度耐力运动可能较为敏感，Mfn2 mRNA与蛋白表达对大强度间歇性运动较敏感，不同运动方案可能激活不同的基因或蛋白信号。大强度间歇性运动增加线粒体Mfn2蛋白表达，可能增加了线粒体融合活性。由于Mfn2在代谢调节中的重要作用，本实验推测，大强度间歇性运动对骨骼肌线粒体代谢的影响可能比长时间低强度耐力运动还要大。但本实验尚不能对这些差异作更深入的机制性解释。

线粒体分裂是调节线粒体空间形态的另一重要机制。哺乳动物细胞系的研究表明，阻断线粒体分裂导致线粒体膜电位崩溃、ROS增加、蛋白质氧化增加以及mtDNA丢失［18］，线粒体分裂还关联着线粒体的功能调节［19］、细胞凋亡［20］与线粒体疾病的发生（神经退行性疾病［21］与骨骼肌萎缩等［22］）。研究发现，哺乳动物的线粒体分裂由Drp1、hFisl介导。孙卫东等研究表明，急性运动中骨骼肌hFisl mRNA表达明显增加，运动后骨骼肌hFisl mRNA逐渐减少；运动后24 h未恢复到安静水平，hFisl基因的动态表达是线粒体对细胞能量需求急增的一种快速应答反应［5］。本研究旨在观察长期运动对hFis1基因表达的累积效应，发现长时间低强度耐力运动和大强度间歇性运动对骨骼肌hFisl mRNA表达均无显著影响；由于hFis1基因表达的快速应答特点，本研究认为，hFisl mRNA表达对急性运动可能比较敏感，长期运动并未导致hFisl mRNA表达水平的适应性改变。相对耐力运动而言，Drp1受大强度间歇性运动的影响比较显著。大强度间歇性运动导致Drp1 mRNA表达上调（P< 0.05），但线粒体Drp1蛋白表达下调（P < 0.05），Drp1 mRNA及其蛋白表达均显著区别于耐力运动组（P < 0.05），表明Drp1基因与蛋白对两种运动方式有着显著不同的适应机制，这种差异依然来源于运动方案的差异。与Mfn1/2、OPA1和hFis1不同的是，Drp1蛋白结构不含线粒体跨膜序列［3］。Drp1定位于胞浆，线粒体分裂时才被hFis1募集［23］，Drp1在线粒体组分中的蛋白水平可近似地反映hFis1对Drp1的募集程度，进一步可反映线粒体的分裂活性。因此，Drp1蛋白下调的结果提示：大强度间歇性运动很可能抑制了线粒体的分裂活性，这与线粒体Mfn2蛋白上调可能协同促进线粒体融合。长时间低强度耐力运动未见此效应。

由于线粒体融合、分裂与代谢之间密切相关，我们推测，运动对线粒体管网结构的动力学影响很可能参与了线粒体的代谢调控。研究表明，线粒体融合分裂与骨骼肌胰岛素敏感性、脂肪酸氧化、线粒体生物发生、代谢可塑性以及能量生成关系密切［24］。Mfn2介导线粒体融合的同时，也能调节氧化磷酸化相关基因表达，促使线粒体膜电位形成［12］。Mfn2表达抑制不仅导致线粒体融合抑制，还导致脂肪合成速率下降、高脂血症、胰岛素抵抗［25］。鉴于Mfn2的重要代谢调控作用，本实验极有意义的生理发现是，两种运动方式诱导了不同的Mfn2表达变化，Mfn2在调节线粒体融合的同时，也可能控制着骨骼肌对两种运动方式的不同代谢适应。这一发现对代谢性疾病的运动防控策略有一定指导意义。

4 总结

线粒体融合分裂基因以及线粒体Mfn2、Drp1蛋白，对长时间低强度耐力运动和大强度间歇性运动有不同的适应机制，这种差异来源于运动方案的差异。大强度间歇性运动可能在Mfn2、Drp1基因转录与蛋白表达两个水平显著影响骨骼肌线粒体的融合分裂；而长时间低强度耐力运动仅对Mfn1基因转录有显著上调作用。

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