对氨基酸纸层析实验的改进

陈舒丽， 王梅娟， 罗丽丹， 刘汉才， 罗德生 (咸宁学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室， 咸宁437100;通讯作者，E-mail:jxa12419@126.com)

纸层析是以滤纸作为支持物分离混合物的一种分配层析方法。滤纸纤维和水有较强的亲和力，与有机溶剂的亲和力很弱。故而在层析时，以滤纸纤维及其结合的水作为固定相，以有机溶剂作为流动相。当流动相沿纸经过样品时，样品点上的溶质在水和有机相之间不断进行分配，随着流动相的不断移动，各种不同的部分按其各自的分配系数不断进行分配，从而使物质得到分离和提纯［1］。纸层析法是常用的一种分离混合氨基酸的方法，也是大中专院校生物化学实验中的一个常规性实验。在多年的实验教学中，我们发现有些试剂及实验步骤需要改进。传统实验中，通常用苯酚做展层剂。苯酚是一种有毒物质，对皮肤有较强的腐蚀性，对人体毒性较大，而且价格较贵。传统实验中，氨基酸层析完毕后，用茚三酮溶液喷雾显色，由于喷雾不均，容易造成显色不均。本研究将茚三酮加入展层剂中，通过比较苯酚与3种浓度不同的乙醇作为展层剂的效果，从而降低实验试剂对人体的危害，简化实验步骤，降低实验成本，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 0.1 mol/L丙氨酸溶液，0.1 mol/L谷氨酸溶液，0.1 mol/L丙氨酸及谷氨酸混合液，0.01 mol/L(pH 7.4)磷酸盐缓冲液，0.1% 茚三酮溶液，水饱和苯酚溶液，65%，75%，85%乙醇－茚三酮溶液。

1.2 实验方法

1.2.1 点样 取直径10 cm圆形滤纸一张，用圆规作半径0.8 cm的同心圆，将圆周平均分成三部分，分别标记1，2，3。用毛细管在滤纸的1处点加丙氨酸和谷氨酸混合液2滴，2和3两处分别点加丙氨酸和谷氨酸溶液各1滴。

在滤纸圆心处打一小孔(如铅笔芯大小)，另取一条状滤纸，长约4 cm，宽约2 cm，下一半剪成须状，卷成圆筒，如灯芯插入小孔，勿使其突出滤纸面。

1.2.2 层析和显色 在8个直径为10 cm的圆形层析缸中分别加入4种不同的展层剂，即水饱和苯酚，65%，75%，85%乙醇溶液(含0.1%茚三酮)，每种溶液均平行做2份。把滤纸平放在展层缸上，使灯芯浸入展层剂中，溶剂沿灯芯上升到滤纸，并向四周扩散，待溶剂前沿扩散至滤纸边缘约1 cm时，取出滤纸，用铅笔划出溶剂前沿，在烤箱中烤干。由于乙醇展层剂中直接加入了茚三酮，故从烤箱中取出的6张滤纸上有紫色的弧形色斑;用水饱和苯酚做展层剂的滤纸拿出后喷0.1%茚三酮溶液，放入烤箱中第二次烤干，出现紫色的弧形色斑。用铅笔描出色斑轮廓，取两份平行结果的平均值，以下列公式计算迁移率(Rf):

2 结果

经过展层作用后，谷氨酸与丙氨酸在4种展层剂中的迁移率见表1，层析图谱见图1－4。

表1 两种氨基酸在四种配方中的迁移率

图1 不同展层剂的层析图谱

通过计算2种氨基酸的Rf值及8张滤纸的层析图谱结果可以看到:点样1处的混合氨基酸均可以分离，离点样点较远的斑点为丙氨酸，离点样点较近的斑点为谷氨酸;水饱和苯酚溶液和75%乙醇分离氨基酸的效果最为明显，且2种氨基酸在2种展层剂中的迁移率也较接近;65%乙醇分离效果不如上述2种展层剂明显，但是仍然可以分离;而85%乙醇分离效果较差，2种氨基酸的迁移率均较小。由此可以说明，用75%乙醇制成的展层剂能达到分离混合氨基酸的目的，而且效果较好。

3 讨论

3.1 两种展层剂的比较 原展层剂中苯酚是一种有毒的有机试剂，对皮肤、黏膜有强烈的腐蚀作用，可抑制中枢神经或损害肝、肾功能;吸入蒸气可引起头痛、头昏、乏力、视物模糊等症状［2］。由于腐蚀性极强，操作时应戴手套及防护镜等，所有操作均应在通风橱中进行;这些都给实验操作带来不便。而新展层剂中的乙醇则安全无毒，没有腐蚀性。因此在实验操作中，无须戴手套，也不用在通风橱中进行。这些既简化了实验的操作过程，又避免了苯酚对实验人员的毒性;而且与苯酚相比较，乙醇价格便宜，可以节约实验室开支［3］。

3.2 两种显色方法的比较 如果展层剂中没有加入显色剂茚三酮，需展层完毕烘干后将茚三酮喷雾在滤纸上。由于是手动操作，容易造成喷雾不均，色斑显色不均匀，易扩散，使得滤纸表面不干净，影响Rf值的测定。为了克服这一缺点，本实验将茚三酮溶解于展层剂中［4］。在层析过程中，茚三酮随展层剂沿滤纸向四周扩散，由于固定了显色剂的量，故从烤箱中取出滤纸后能看见蓝紫色色斑均匀分布在滤纸上，显色效果较好，滤纸表面比较干净，利于Rf值的测定，不仅缩短了实验时间，而且使操作更简单，效果更好［5］。

综上所述，用75%乙醇配制的展层剂，可以代替原有的水饱和苯酚，能够较好地分离氨基酸;另外将茚三酮加入展层剂中，可以更好地显色。以上改进，不仅简化了实验步骤，缩短了实验时间，优化了实验结果，并且对人体没有任何毒性和腐蚀性，达到了预期的效果。

［1］ 罗德生，刘红梅，李映红，等.生物化学与分子生物学实验教程［M］.北京:科学出版社，2007:83－85.

［2］ 杨若明.环境中有毒有害化学物质的污染与监测［M］.北京:中央民族大学出版社，2001:152－154.

［3］ 王筑婷，吴青青.圆形纸层析法鉴定转氨基作用的实验改进［J］.贵阳医学院学报，2008，33(4):418 －419.

［4］ 榻金彩，周桂.对“植物体内的转氨基作用”实验的改进［J］.生物学通报，2006，41(1):50 －51.

［5］ 田明，高铮，苏英华，等.氨基酸纸层析实验的进一步探讨［J］.实验室科学，2009，28(6):64 －65.