‘国庆1号'温州蜜柑未发育胚珠再生完整植株的研究

蔡小东,骆 浩 (长江大学园艺园林学院,湖北荆州434025)

柑橘是我国南方重要的主栽果树之一,通过生物技术进行柑橘的遗传改良是一个切实可行的方法[1]。体细胞胚状体 (体胚)发生是植物体细胞离体培养的重要途径之一。许多植物器官、愈伤组织及原生质体等培养过程中,体胚能否再生关系到完整植株再生的成败[2-3]。现代生物技术育种已被广泛应用于作物遗传及品质改良,如转基因技术、体细胞融合技术等一般都需要通过体胚再生途径获得完整植株[4-5]。本研究以 ‘国庆1号'温州蜜柑 (Citrus unshiu Marc.cv.Guoqing No.1)成熟果实中未发育胚珠为外植体,研究不同种类的植物生长调节剂对 ‘国庆1号'植株再生的影响,以期为直接以未发育胚珠为起始材料进行柑橘生物技术育种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为 ‘国庆1号'温州蜜柑 (Citrus unshiu Marc.cv.Guoqing No.1)成熟果实。在超净工作台上将果实浸泡在75%酒精中约10min后,用镊子取出并用酒精灯外焰灼烧30～60s。接着将果实放入已灭菌的培养皿 (内放有多张滤纸)中剥开果皮,去掉果肉后可发现囊衣内紧靠中柱处有许多长约1～2mm未发育胚珠,用尖嘴镊子将这些未发育胚珠轻轻挑下备用。

1.2 胚状体诱导

将上述未发育胚珠分别接种于下述培养基A(MT+500mg·L-1麦芽浸出物 (ME))、B(MT+1.0mg·L-1GA3+500mg·L-1ME)、C(MT+2.0mg·L-1BA+0.5mg·L-1IAA)和D(MT+1.0mg·L-1KT+500mg·L-1ME)上。

所有培养基均添加30g·L-1蔗糖及7.5g·L-1琼脂,pH5.8,暗培养。每种处理接种5瓶,每瓶放置3～5个胚状体。

1.3 胚状体诱导生芽

将获得的胚状体接种到培养基E(M T+2.0mg·L-1BA+0.5mg·L-1IAA)上。接种5瓶,每瓶接种5个胚状体,培养后统计出芽的时间、快慢、质量及数量等。

1.4 再生芽诱导生根

将再生芽切下,置于诱导生根培养基上 F(MT+0.5mg·L-1NAA+0.1mg·L-1IBA+0.5g·L-1活性碳+20g·L-1蔗糖+7.2g·L-1琼脂)和G(1/2MT+0.5mg·L-1NAA+0.1mg·L-1IBA+0.5g·L-1活性碳+20g·L-1蔗糖+7.2g·L-1琼脂)上。每种处理接种5瓶,每瓶接种3个芽,比较再生根的时间及根的质量。

2 结果与分析

表1 ‘国庆1号'成熟果实中未发育胚珠在不同培养基上胚状体的诱导率

2.1 未发育胚珠的胚状体诱导

将 ‘国庆1号'温州蜜柑成熟果实中未发育胚珠接种于A～D 4种培养基中,结果表明,在暗培养60d后,4种供试培养基都能诱导胚状体的再生,诱导率如表1所示。柑橘体细胞胚状体的发育过程一般与合子胚一样,具有经过原胚、心形胚、鱼雷形胚及至具子叶的成熟胚的发育程序。在培养基A和C中既有球形胚状体的产生,也出现了子叶形胚状体。在这4种培养基中,培养基A中胚状体的诱导率为24.64%,培养基D中胚状体诱导率高达28%。此外,在诱导胚状体的过程中,未发现有胚性愈伤组织的出现。这些胚状体继续在原培养基上培养30d后,有次生胚状体发生,大部分表现畸形 (图1(a)和 (b))。图1(a)所示为培养基A中再生的胚状体,且再生了次生胚状体,由于暗培养呈淡黄色同时还伴有白色子叶型胚状体。

2.2 胚状体诱导生芽

胚状体在生芽培养基上培养15d后,如图1(c)所示,胚状体开始膨大变绿,有次生胚状体的产生,培养30d后胚状体体积明显增大。少数胚状体萌发形状不规则的小芽。通过45d的光照培养,胚状体再生了不定芽 (图1(d))。不定芽的叶片不规则,个别部位有黄化现象。生长出来的芽后期生长速度加快,形成植株的茎叶形态。

2.3 再生芽诱导生根

挑选部分较为健壮的芽进行根的诱导,以获得 ‘国庆1号'的完整植株。在培养30d后培养基J的生根数量明显多于培养基K,K培养基同样也能够使再生芽诱导生成不定根,但是较培养基J的根细,侧根较少 (表2)。培养基J中不定芽叶片大且绿,培养基 K的叶片生长势叶片较黄(图1(e)和 (f))。由此可见,J培养基更加有利于根的诱导。

表2 ‘国庆1号'温州蜜柑胚状体诱导生根

3 讨论

一般而言,柑橘成熟果实中未发育胚珠经诱导能产生大量的胚性愈伤组织[3,6-8]。本研究以 ‘国庆1号'温州蜜柑成熟果实中未发育胚珠为外植体,研究了不同种类的植物生长调节剂对 ‘国庆1号'植株再生的影响,结果发现很难获得愈伤组织,即使再生了愈伤组织也极易玻璃化。以成熟果实未发育胚珠为外植体,直接进行植株再生,具有操作简单易行、容易再生植株等优点。并且愈伤组织的遗传生理功能可能具有胚性,或是丧失胚性,具有胚性的愈伤组织才具有较强的再分化能力,可以再生植株,是各种生物技术操作的理想材料。此外,愈伤组织随着继代次数的增加和保存时间的延长,其胚胎发生能力会下降,并且存在变异[9-12]。外植体脱分化为愈伤组织,抑或再分化为体细胞胚胎,终归是在各种因素的诱导下基因时空差异表达的结果。深入研究离体培养下植物细胞脱分化及再分化的分子机制,将为促进利用生物技术创造新新种质和遗传改良奠定基础,具有重要意义。

图1 ‘国庆1号'未发育胚珠再生植株

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